肖 冰 石玉秀 韩 芳

（中国医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室，沈阳110001）

创伤后应激障碍 （posttraumatic stress disorder，PTSD）是指由于异常威胁性或灾难性心理创伤导致延迟出现和长期持续的精神障碍。其临床表现以再度体验创伤特征，并伴有情绪的易激惹和回避行为，简而言之，PTSD是一种创伤后心理失衡状态［1］。PTSD是应激疾病中最为典型的一种［2］。研究报道，大脑内侧前额叶皮质区在脑的情绪调节过程中起到重要的作用［3，4］。

研究发现，许多生理或病理条件均可引起内质网腔内未折叠或错误折叠蛋白堆积、或钙离子耗竭等，这些内质网的稳态失衡即为内质网应激（endo-plasmic reticulum stress，ERS）。为消除这种应激，内质网迅即启动未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR），未折叠蛋白反应是包括蛋白合成暂停、内质网分子伴侣和折叠酶表达上调、内质网相关性降解等在内的一种综合性反应［5］。GRP78存在于细胞质内质网膜上，参与内质网应激，是内质网应激的标志蛋白［6］。

本研究采用国际上公认的SPS模型，采用免疫组 化、Western Blotting 和 RT-PCR 等 方 法 对PTSD大鼠前额皮质神经元GRP 78进行了检测，旨在为研究GRP 78是否参与PTSD的发生，为揭示PTSD部分发病机制提供理论和形态学证据。

材料和方法

1.实 验动物及动物模型的建立

采用6周-7周龄雄性Wistar大鼠（中国医科大学实验动物中心提供）60只，实验起始体重（180±20）g，12h光亮／黑暗条件、22℃-25℃环境温度，分隔喂养，食物和水可自由摄取；随机分为4组，即SPS的1d、4d、7d组及正常对照组。

2.P TSD样大鼠模型的建立

采用日本文部省召开的“基础和临床的研究进展”的会议确定的关于PTSD模型—SPS刺激后无干扰喂养的方法。SPS刺激是指将大鼠连续进行下述步骤处理，即：大鼠禁锢2h后，立即强迫游泳20min（水深40cm，水温25℃）。经过15min的恢复，乙醚麻醉至意识丧失。大鼠经过SPS处理后在笼子中不再给予任何刺激，分别常规饲养1天，4天，7天后取材。

3.光 镜标本制备

大鼠经0.4%戊巴比妥腹腔注射麻醉后，暴露心脏，左心室插管，剪开右心耳，先以生理盐水300ml快速灌冲，再灌注4%多聚甲醛进行固定，取出脑组织，并浸入同种固定液中续固定3h，然后浸于 Holt＇S液（30%蔗糖，0.01mol／L PBS配制）中至沉瓶底。于恒冷箱冰冻切片机中行冠状切片，片厚10μm，用于免疫荧光染色。

4.免 疫组化（PV法）进行GRP78染色与图像分析

冰冻切片经吹干用0.3%Triton（0.01mol／L PBS配制）洗5min×3次，3%H2O2室温孵育30min，0.01mol／L PBS洗5min×3次，滴加小鼠抗大鼠GRP 78IgG（购于美国Sigma公司，工作浓度1∶100），4℃过夜后经0.01mol／L PBS洗5min×3次，滴加羊抗小鼠IgG（PV试剂盒购于ZSGB-BIO公司）37℃孵育30min DAB显色，常规脱水，透明，中性树胶封片。光学显微镜（OLYMPUS，BX60，Japan）下观察，摄片。

应用 MetaMorph／DPIO／BX41形态学图象分析系统软件，对上述免疫组化染色切片进行了半定量分析。在高倍（10×40倍）视野下，每张免疫组化染色切片取5个视野，记录每个视野内阳性细胞光密度值，取平均光密度。每组大鼠共选取5张切片，结果进行统计学分析，所有数据以¯x±s表示。采用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析，检验水准α＝0.05。

5.免 疫印迹法测定

实验组和对照组大鼠每组5只。脱颈法处死大鼠，断头，冰上快速分离前额皮质，加入裂解液，考马斯亮蓝法蛋白质定量后，聚丙烯酰胺凝胶电泳，PVDF膜电转印，封闭，小鼠抗大鼠GRP78一抗（1∶2000，Santa Cruz）4℃孵育过夜、辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠1∶5000室温孵育1h，ECL显色。应用Image J分析软件分析上述结果，以目的条带与内参照β-actin的平均灰度值的比值表示蛋白水平，进行半定量分析。

6.逆 转录－－聚合酶链式反应检测

将实验组及对照组大鼠麻醉后断头取脑，分离前额皮质，利用Trizol试剂提取总RNA，用分光光度计定量后-80℃保存。取1μgRNA，按照试剂盒说明书进行逆转录和PCR扩增。引物由上海生工生物工程技术公司合成，各引物序列见表1。GRP78 PCR 扩增条件均为：94℃ 2min；94℃ 30s；56℃30s；72℃40s；30个循环，72℃5min。β-actin PCR扩增条件：94℃ 4min；94℃ 40s；58℃ 30s；72℃30s；30个循环，72℃8min。扩增结束后取5μl扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，利用天能GIS凝胶成像系统进行观察拍照并进行积分光密度分析，以目的条带与内参照β-actin的平均吸光度的比值表示相对表达水平，进行半定量分析。

表1 GRP78和β-actin引物序列Table 1 Primers for GRP78andβ-actin

7.统 计学处理

所得数据使用SPSS 11.0统计软件。计量资料用平均数±标准差（¯x±s）表示，进行方差分析和t检验，P＜0.05为差异有显著性。

结 果

1.免 疫组化检测GRP 78

GRP 78免疫组化结果显示，正常组大鼠皮质细胞内中有GRP 78阳性信号，免疫组化染色阳性信号为棕黄色，阳性表达的GRP 78染色定位于细胞浆，细胞核反应阴性。在正常对照组（图A），GRP 78有一定量的表达，经过SPS刺激后，在SPS 1d（图B）、4d（图C）、7d（图D），GRP 78的表达出现逐渐上调，7d是表达最多（P＜0.05）。分析结果见图1。

图A 正常对照组GRP 78免疫反应阳性细胞 ×400 图B SPS 1天组GRP 78免疫反应阳性细胞 ×400图C SPS 4天组GRP 78免疫反应阳性细胞 ×400 图D SPS 7天组GRP 78免疫反应阳性细胞 ×400Fig.A Immunoreaction of GRP 78in control group×400 Fig.B Immunoreaction of GRP 78in SPS 1dgroup×400Fig.C Immunoreaction of GRP 78in SPS 4dgroup×400 Fig.D Immunoreaction of GRP 78in SPS 7dgroup×400

图1 模型组和对照组GRP 78的免疫组化结果分析Fig.1Immunohistochemistry analysis of GRP 78in the model group and control group

2.免 疫印迹法检测前额皮质GRP 78的表达

采用免疫印迹法检测GRP 78，以β-actin的吸光度值作为内参照，对各组条带的吸光度值进行校正和半定量分析。与正常对照组相比，模型组前额皮质GRP 78蛋白水平变化明显：SPS刺激后1d后表达开始逐渐增加，7d表达最多（图2-1）。分析结果见图2-2.

3.R T-PCR检测前额皮质GRP 78mRNA的表达

PCR图像（图3）显示，在正常组大鼠前额皮质中GRP 78mRNA有少量表达，SPS刺激后，GRP 78mRNA的表达出现逐渐上调的趋势（P＜0.05），分析结果见图4.

图2-1 模型组和对照组GRP 78蛋白的免疫印迹分析Fig.2-1Western blotting analysis of GRP 78protein in the model group and control group

讨 论

近年来，随着战争、社会暴力事件、重大交通事故和自然灾害等创伤意外的不断增多，PTSD发病率越来越高，严重影响了患者生活质量和社会稳定。不同于一般的应激反应及其它精神疾病，PTSD患者存在明显的下丘脑－垂体－肾上腺轴负反馈抑制作用增强和低皮质醇反应及一定程度的海马、杏仁核、Broca's区等结构影响形态学改变［7，8］。以往由于缺乏理想的动物模型，使PTSD的基础研究受到了很大限制。SPS模型作为PTSD动物模型的确认，为深入研究应激障碍的发病机制提供了行之有效的方法［9］。

GRP78又称免疫球蛋白结合蛋白（Bip），是热休克蛋白70家族的成员之一，位于内质网上，是内质网应激的标志蛋白。组织器官在缺血、钙平衡紊乱等应激情况下，通过内质网未折叠蛋白反应可使GRP78大量表达［10］并与内质网中错误折叠和未折叠蛋白结合，恢复蛋白质的正确构象，使蛋白质能够在细胞应激状态下、继续正确合成，维持内环境稳定［11］。研究报道，PTSD患者额叶内侧皮质功能下降，对创伤事件的敏感度增加，可能与PTSD病人的闯入性记忆症状有关［12］。

本实验中我们采用免疫组化和 Western blotting，重点观察了PTSD大鼠前额皮质内GRP 78的变化。利用免疫组化证实了GRP78的存在，并且通过免疫印迹和RT-PCR技术分别从蛋白水平和mRNA水平对其进行了定量的检测，检测结果显示GRP78表达在SPS刺激后发生了明显的变化，出现了逐渐上调的趋势。鉴于GRP78在内质网应激中的重要作用以及大脑前额皮质在情绪调节中的重要作用，PTSD大鼠前额皮质GRP78表达的升高，说明PTSD存在内质网应激，GRP78的表达变化可能与PTSD持续性情感行为障碍、认知功能受损的发生发展过程有关。该实验的研究结果证实了PTSD的发生有内质网应激有关，这也为进一步揭示PTSD神经生物学发病机制以及开辟治疗新途径提供了实验依据。但本实验仅局限于对PTSD样情感行为异常大鼠前额皮质GRP 78的研究，关于内质网应激如何在PTSD的发生发展中如何起作用还有待于进一步的研究。

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