宋 华 朱红年 郭 慧 周乃珍 陈 慧 张盛周

（安徽师范大学生命科学学院，生物环境与生态安全省级重点实验室，芜湖241000）

黑眉锦蛇（Elaphe taeniura）俗称家蛇，隶属爬行纲有鳞目游蛇科，是一种大型无毒蛇，其肉味鲜美，蛇蜕、蛇肉、蛇胆等均可入药，具有较高的经济价值，该蛇的人工养殖已引起了广泛重视。消化道黏膜酶的分布反映了消化道不同部位的消化和吸收机能。目前，有关低等脊椎动物消化道黏膜酶的研究主要集中在鱼 类［1－3］和 两 栖 类［4－5］，对 爬 行 动 物 的 研究较少［6］，黑眉锦蛇消化道酶的研究未见报道。本文采用酶组织化学技术，对其消化道酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）、碱 性磷酸酶 （alkaline phosphatase，AKP）、过 氧 化 物 酶 （peroxidase，POX）、非特异性酯酶（nonspecific esterase，NSE）、腺苷三磷酸酶（adenosine triphosphatase，ATPase）和琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）等6种酶进行了定位和活性研究，旨在增进对黑眉锦蛇消化机能的认识，为黑眉锦蛇人工养殖提供参考资料。

材料和方法

1.材 料

黑眉锦蛇5条，购自芜湖市水产市场，正常无伤害，重320-455g，长135-160cm。剪去头部处死，迅速解剖，取出完整消化道，按下列8个部位取材：食道、胃贲门、胃体、胃幽门、十二指肠、空肠、回肠和直肠。生理盐水快速洗净，分3组进行组织切片：第1组于－23℃冰冻切片，切片厚度6μm，甲醇固定1 min；第2组于－23℃冰冻切片，切片厚度6μm，不固定；第3组用Carnoy氏液固定5h，常规石蜡包埋，切片厚6μm。

2.酶 组织化学方法

2.1 ACP采用Carnoy氏液固定的石蜡切片，参考铅法显示［7］。孵育液配制：0.2mol／L 醋酸缓冲液（pH 5.2）、0.24% 硝酸铅和3% β－甘油磷酸钠混匀后，至35℃水浴内，30min后过滤待用。常规石蜡切片脱蜡至水，入孵育液，35℃，24h；35℃蒸馏水浸洗，入2% 硫化铵2min，蒸馏水浸洗。

2.2 ALP采用经甲醇固定的冰冻切片，参考NBT／BCIP法显示［4］。孵育液配制：碱性磷酸酶缓冲液（pH 9.2-9.4）、5% 硝基蓝四唑（NBT）和5%5－溴-4-氯-3-吲哚－磷酸盐（BCIP）混匀即可，此孵育液需在30min内使用。将配好的NBT／BCIP溶液滴加在切片材料上显色20min，蒸馏水浸洗。

2.3 POX采用未固定的冰冻切片，参考DAB法显示［8］。孵育液配制：3，3-二氨基联苯胺（DAB）、0.1mol／L Tris-Cl缓 冲 液 （pH 7.6）和 0.2%H2O2（新配制）充分混合，调pH至7.6，过滤待用。滴加孵育液于切片上，35℃，30min；蒸馏水浸洗。

2.4 NSE采用未固定的冰冻切片，参考偶氮法显示［4］。孵 育 液 配 制：α－乙 酸 萘 酯、丙 酮、0.1mol／L PBS（pH 7.4）和六偶氮对品红充分混匀后，用2mol／L NaOH调pH至5.8即可，此孵育液需在20min内使用。将切片浸入孵育液15min，蒸馏水浸洗。

2.5 ATPase采用未固定的冰冻切片，参考钙－钴法显示［7］。孵育液配制：腺苷三磷酸二钠盐（ATP钠盐）溶于蒸馏水，用2mol／L NaOH 调pH至9.2，再依次加入2% 巴比妥钠、2%CaCl2、蒸馏水和2，4-二硝基苯酚（DNP），充分混匀后，再用2 mol／L NaOH 调pH 至9.0，置35℃水浴15min后过滤待用。冰冻切片先置于35℃1%CaCl2中5 min；滴加孵育液，35℃，1.5h；蒸馏水浸洗后，入2% 硝酸钴内5min；蒸馏水浸洗，入20℃4% 中性甲醛固定2min；流水冲洗后入2% 硫化铵内2 min；蒸馏水浸洗。

2.6 SDH采用未固定的冰冻切片，参考四唑盐法显示［7］。孵育液配制：0.4% 硝基蓝四唑（NBT）、0.1mol／L PBS（pH 7.4）和0.2mol／L琥珀酸钠盐充分混匀。滴加孵育液室温显色45min；蒸馏水浸洗。

3.光 密度测定与数据统计分析

利用Olympus BX61型显微镜，在400倍视野下，观察切片并拍照。采用Image-Pro Plus图像分析软件，对酶组织化学染色阳性部位进行光密度分析，测出切片中阳性部位的累积光密度（integrated optical density，IOD）和面积（area），每个部位每种酶观察10张切片取30个视野，算出平均光密度（mean optical density，MOD）。阳性部位染色越深，平均光密度值越大，以平均光密度值表示消化道各部位酶活性的强弱，采用单因素方差分析（oneway ANOVA）对各种酶的活性变化进行差异显著性比较，P＜0.05为差异显著。

结 果

光镜下，消化酶的分布部位呈现明显的组织化学染色反应，经光密度定量分析后，黑眉锦蛇消化道黏膜6种酶的分布见表1。

表1 黑眉锦蛇消化道6种酶的分布Table 1 Distribution of six types of enzymes in the digestive tract of Elaphe taeniura

1.酸 性磷酸酶（ACP）

ACP活性部位呈棕黄色或棕黑色（图1，2），仅在十二指肠、空肠和回肠有分布，十二指肠和空肠酶活性较高，回肠酶活性显著较低（P＜0.05）。十二指肠和空肠酶活性自黏膜上皮基底至纹状缘处逐渐增高，且在上皮细胞内呈颗粒状分布。回肠酶活性则主要位于上皮基底和纹状缘处，黏膜固有层中亦有少量分布（图2）。

2.碱 性磷酸酶（ALP）

ALP活性部位呈蓝紫色（图3，4），在食管及十二指肠至回肠有分布，以十二指肠酶活性最高，回肠、空肠次之，食管最低，各部位酶活性差异显著（P＜0.05）。酶活性主要位于消化道黏膜上皮，食管酶活性自上皮基底至游离端逐渐增高，而十二指肠至空肠酶活性主要聚集在近纹状缘处。

3.过 氧化物酶（POX）

POX活性部位呈黄色或棕黄色（图5，6），在消化道各段均有分布，肠道及食管至胃体酶活性较高，而胃幽门酶活性显著较低（P＜0.05）。POX在消化道的黏膜上皮和黏膜固有层中均存在，但主要分布于上皮基底处的细胞中，且多呈颗粒状分布（图6）。

4.非 特异性酯酶（NSE）

NSE活性部位呈棕红色（图7，8），在消化道各段均有分布，以胃幽门、十二指肠和胃体酶活性显著较高（P＜0.05），胃贲门和回肠其次，食管和空肠较低，直肠酶活性最低（P＜0.05）。在消化道黏膜上皮和黏膜固有层也均有酶活性存在，但黏膜上皮和胃腺中酶活性较高。食管NSE活性主要在上皮基底和近游离端，胃部酶活性主要在上皮细胞基底和胃腺中。肠部各段相似，酶活性在黏膜上皮中分布较均匀，近纹状缘处稍高。

5.腺 苷三磷酸酶（ATPase）

ATPase活性部位呈棕黄色或棕黑色（图9，10），在消化道除直肠未检测到酶活性外，其它各部位均有分布，以十二指肠酶活性最高（P＜0.05），胃幽门和胃体其次，胃贲门较低，食管、空肠和回肠显著较低（P＜0.05）。酶活性主要位于消化道黏膜上皮和胃腺部，食管酶活性主要在上皮基底部，胃中胃腺酶活性显著高于黏膜上皮酶活性，肠道酶活性自上皮基底至纹状缘处逐渐增高。

6.琥 珀酸脱氢酶（SDH）

SDH活性部位呈蓝紫色（图11，12），在消化道除食管未检测到酶活性外，其它各部位均有分布，胃幽门和胃体酶活性显著较高（P＜0.05），胃贲门和十二指肠其次，空肠至直肠显著较低（P＜0.05）。胃中酶活性主要集中于胃腺部和上皮基底处，胃腺部酶活性较高；肠道酶活性自上皮基底至纹状缘处逐渐增高（图12）。

讨 论

磷酸酶属于水解酶类，是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，根据其催化活性所依赖的pH不同，可分为酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（ALP）两类。ACP定位于溶酶体中，丰富的ACP活性表明该区域具有活跃的吸收和细胞内消化功能［9］。本研究显示黑眉锦蛇ACP主要分布在十二指肠和空肠，与许氏平鲉（Sebastes schlegeli）［1］、欧洲无须鳕（Merluccius merluccius）［2］、褐菖鲉（Sebastiscus marmoratus）［3］ACP在胃和肠道各段均有分布及牛蛙（Rana catesbeinana）［4］主要分布于胃部明显不同，显示出较大的种间特异性。ALP主要位于细胞质膜上，与物质的跨膜运输及磷代谢密切相关，它的存在表明该部位具有较强的吸收功能，ALP活性和脂类的吸收呈正相关，一般将ALP的活性作为脂类吸收强弱的指示物［10］。鱼类和牛蛙消化道 ALP主要分布于肠道各段［1－4］，本研究结果与其基本一致。黑眉锦蛇ACP和ALP均主要分布于肠道，均以十二指肠酶活性最高，表明黑眉锦蛇肠道具有活跃的消化吸收及细胞内消化功能。

POX主要存在于细胞过氧化物酶体中，POX可降低或消除过氧化氢、酚类和胺类等细胞毒性物质，对细胞起保护作用［11］。POX还参与脂类代谢，也被视作一种具有免疫功能的酶［12］。本研究表明，POX除胃幽门活性较低，其它部位活性均较高，尤其是直肠活性最高，这和商城肥鲵（Pachyhynobius shangchengensis）［5］和丽纹龙蜥（Japalura splendida）［6］POX在胃和肠活性较弱有所不同，显示出一定的种间特异性。POX在黑眉锦蛇消化道各部位的分布及活性高低，可能与该部位产生的毒性物质的种类及多少有关，对组织细胞起到保护作用。

NSE属羧酯水解酶类，参与酯类的消化作用［7］。NSE在不同动物消化道中分布差异较大，褐菖鲉和丽纹龙蜥主要分布于胃［3，6］，商城肥鲵主要在胃和肠［5］，许氏平鲉主要在肠道［1］，而欧洲无须鳕和牛蛙在消化道各段均有分布［2，4］。本研究显示NSE在胃腺和消化道黏膜上皮分布较多，这表明NSE能够分泌到消化腔中对酯类进行细胞外消化。消化道各段NSE的大量存在，表明黑眉锦蛇消化道各部位均可消化酯类物质。

ATPase是普遍存在于组织细胞膜及细胞器膜上的一种糖蛋白，主要作用是通过水解ATP释放能量进行逆化学梯度的离子转运，维持细胞膜内外的离子梯度差，参与肠上皮细胞对营养物质的吸收作用［13，14］。牛 蛙 ATPase在 消化道各段 均 有 分布［4］，黑眉锦蛇ATPase在除直肠外的消化道各段均有分布，胃部和十二指肠处ATPase活性较高，胃中酶活性位于胃腺部，可能与胃蛋白酶和胃酸的分泌有关。十二指肠酶活性最高且集中于纹状缘，显示十二指肠是黑眉锦蛇消化道主要吸收部位。

SDH属氧化还原酶类，是脱氢酶中最重要的酶，是参与三羧酸循环的关键酶，其活性直接影响三羧酸循环的速率［15］。SDH的大量存在，表明此处正在进行着活跃的物质和能量代谢。黑眉锦蛇SDH在除食管外的消化道各段均有分布，胃中胃腺部酶活性较高，可能与胃腺进行大量的胃酸、黏液物质和胃蛋白酶的合成与分泌相关。

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图 版 说 明

图11 胃幽门琥珀酸脱氢酶

图12 空肠琥珀酸脱氢酶

L：消化道腔；LP：固有层；CG：贲门腺；FG：胃底腺；PG：幽门腺；ME：黏膜上皮；SB：纹状缘；标尺：50μm

EXPLANATION OF FIGURES

图1 空肠酸性磷酸酶

图2 回肠酸性磷酸酶

图3 食道碱性磷酸酶

图4 回肠碱性磷酸酶

图5 食道过氧化物酶（↑）

图6 空肠过氧化物酶（↑）

图7 胃体非特异性酯酶

图8 空肠非特异性酯酶

图9 胃幽门腺苷三磷酸酶

图10 十二指肠腺苷三磷酸酶

Fig.1ACP in the jejunum

Fig.2ACP in the ileum

Fig.3ALP in the oesophagus

Fig.4ALP in the ileum

Fig.5POX in the oesophagus（↑）

Fig.6POX in the jejunum （↑）

Fig.7NSE in the stomachus corpus

Fig.8NSE in the jejunum

Fig.9ATPase in the stomachus pyloricus

Fig.10ATPase in the duodenum

Fig.11SDH in the stomachus pyloricus

Fig.12SDH in the jejunum.L：lumen of the digestive tract

LP：lamina propria；CG：cardiac gland；FG：fundic gland；

PG：pyloric gland；ME：mucosal epithelia；SB：striated border；Scale bar：50μm