曹艳丽 王涤非 王晓黎 孟 馨 张 锦 单忠艳

（中国医科大学附属第一医院内分泌科，中国医科大学内分泌疾病研究所，辽宁省内分泌疾病重点实验室，110001，沈阳）

肥胖症易引发胰岛素抵抗、糖尿病、心血管系统疾病等，严重的威胁着人类的健康及生活质量，肥胖已越来越成为国际社会关注的重大问题［1］。肿瘤坏死因子－α（TNF-α）作为肥胖相关胰岛素抵抗的中心介质，其在脂肪组织中水平的升高，尤其在网膜脂肪组织中表达的增高，与心血管疾病的关系密切［2］。TNF-α通过诱导体内纤溶酶原激活物抑制物－1（PAI-1）水平的增加，从而增加了肥胖患者心血管疾病发生的风险［3］。麦没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）作为绿茶中的主要成分，可改善肥胖、胰岛素抵 抗 等 多 种 代 谢 因 素［4－5］。 但 对 于 EGCG 在TNF-α所诱导的内皮细胞中PAI-1产生的影响及机制并不十分清楚。

材料和方法

1.主 要试剂

人脐静脉内皮细胞株CRL-1730购自American Type Culture Collection（ATCC）公司，人重组 TNF－α购自ProSpec-Tany 公司，EGCG（＞98%）购自Cayman公司，兔抗人肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）抗体、细胞外调节蛋白激酶1／2（ERK1／2）、磷酸化细胞外调节蛋白激酶1／2（p-ERK1／2）、羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）购自Santa Cruz公司，测定PAI-1酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒购自Centaur公司。

2.细 胞培养

应用人脐静脉内皮细胞株（HUVECs）进行体外培养。细胞培养基为90%含有2mmol／L谷氨酸、3mg／ml内皮细胞生长因子、200u／ml的青霉素和200mg／ml的链霉素的RMPI 1640培养液和10%的胎牛血清，培养条件为5%的CO2，37℃。将传代生长至90%融合状态时的内皮细胞用无血清的RMPI1640培养液饥饿24h，细胞同步于G0／G1期后与TNF-α和／或EGCG孵育。

3.蛋 白免疫印迹方法检测 ERK1／2、p-ERK1／2、TNFR1蛋白水平

细胞样本中加入细胞核裂解液裂解细胞，超声振荡、离心提取蛋白。测定蛋白样品的蛋白浓度，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳转膜过夜，将蛋白质印迹转至硝酸纤维素膜上，丽春红染色，剪出目的条带；封闭后加入一抗及二抗，最后配制显色剂将膜显色。用Toptal软件对显色后的膜进行扫描同时进行条带灰度的分析，测定目的蛋白和内参照蛋白的电泳条带灰度积分，以二者比值代表目的蛋白的相对表达量，分析结果。

4.E LISA方法测定细胞培养液中PAI-1的水平

ELISA测定步骤按照说明书进行。每个标本和标准曲线均测定三次。PAI-1最小测定浓度为50pg／ml，组内和组间测定差异系数分别为5.5%和8.3%。

5.统 计学处理

数据以¯x±s表示。所有统计分析采用SPSS11.5软件完成。组间差异采用ANOVA方法和Bonferroni检验比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.E GCG抑制TNF－α所诱导的内皮细胞中PAI-1的分泌

TNF-α所诱导的内皮细胞培养液中PAI-1水平的变化呈一时间和浓度依赖曲线。TNF-α（20ng／ml）与HUVECs共同孵育12h后，PAI-1蛋白水平升高约2倍（图1A）。分别以0，10，15，20，30ng／ml TNF-α与内皮细胞孵育12h，PAI-1水平的变化呈浓度依赖变化（图1B）。为进一步观察EGCG是否能抑制TNF-α所诱导的PAI-1水平的变化，先将内皮细胞与20ng／ml TNF-α孵育12h后，再分别加入0，10，30，50μmol／L EGCG共同孵育3h后检测细胞培养液中PAI-1的水平。研究发现随着EGCG浓度的增加，PAI-1的水平逐渐降低，50μmol／L EGCG 可抑制TNF-α所诱导的内皮细胞分泌PAI-1的水平达（62.5±7.8）%（P＜0.01），其与未加入 TNF-α孵育的空白对照组水平无明显差异（图1C）。

图1 A，20ng／ml TNF-α与 HUVECs孵育不同时间后细胞培养液中PAI-1表达的水平。B，不同浓度（0-30ng／ml）TNF-α与HUVECs孵育12h后细胞培养液中PAI-1表达的水平。C，不同浓度EGCG与20ng／ml TNF-α共同孵育12h后细胞液中PAI-1表达的水平。与对照组相比，＊P＜0.05；＊＊P＜0.01。Fig.1 A.Effect of time on TNF-α（20ng／ml）induced PAI-1expression compared to control cells.B.Effects of TNF-α（0-30ng／ml）for 12hon PAI-1expression in HUVECs compared to control cells.C.Effects of increasing concentrations of EGCG on PAI-1expression from HUVECs treated with TNF-α（20ng／ml）for 12hcompared to treatment with 20ng／ml TNF-αwithout EGCG.Bars represent mean±SD.＊P＜0.05；＊＊P＜0.01.

2.E GCG改善TNF－α所诱导的内皮细胞中PAI-1分泌的机制

本研究应用ERK1／2抑制剂－－PD98059（20μmol／L），将其先与HUVECs孵育30min后，再加入TNF－α共同孵育12h，结果表明PD98059可下调TNF－α所诱导的 PAI-1水平的57.69±2.46% （P＜0.01）；在TNF-α与EGCG共同孵育组，PD98059对PAI-1水平的影响无明显统计学意义（P＞0.05）（图2）。

图2 ERK1／2通路抑制后对 TNF-α诱导PAI-1表达的影响。与其他组相比，＊＊P＜0.01。Fig.2Effect of ERK1／2inhibition on TNF-α-induced PAI-1production.＊＊P＜0.01，compared with all other groups.

研究检测了EGCG对TNF－α诱导的ERK1／2磷酸化表达的影响。HUVECs先与EGCG（50μmol／L）孵育3h后再加入 TNF-α（20ng／ml）共同孵育12h。应用蛋白免疫印迹方法检测细胞中ERK1／2和p-ERK1／2水平，结果显示 EGCG 可显著的抑制TNF-α诱导的ERK1／2的磷酸化水平达（60.3±8.4）% （P＜0.05）（图3）。上述数据表明EGCG可能通过ERK1／2途径抑制TNF-α所诱导的PAI-1的表达。

图3 EGCG对TNF-α诱导的p-ERK1／2表达的影响。与空白对照组相比，＊P＜0.05；＊＊P＜0.01。Fig.3Effect of EGCG on TNF-αinduced ERK1／2phosphorylation.＊P＜0.05；＊＊P＜0.01，compared with control group.

同时，本研究还观察了EGCG对内皮细胞中TNFR1表达的影响。HUVECs先与EGCG（50μmol／L）孵育3h后再加入 TNF－α（20ng／ml）共同孵育12h。结果表明在TNF－α处理后，TNFR1的表达较空白对照组下降（38.8±4.1）% （P＜0.01），EGCG单独作用于内皮细胞时并不影响TNFR1的表达，而EGCG作用于TNF－α预处理的内皮细胞中可见TNFR1的表达升高，显著高于TNF－α单独作用所致的TNFR1表达，与空白对照组无显著差异（图4）。这表明EGCG可抑制TNF-α所致的TNFR1表达的下调。

图4 EGCG对TNF-α所致TNFR1表达的影响。与空白对照组相比，＊＊P＜0.01。Fig.4Effect of TNF-αand／or EGCG on TNFR1expression.＊＊P＜0.01，compared with control group.

讨 论

研究结果表明EGCG可能通过抑制ERK1／2磷酸化，从而抑制TNF－α所诱导的内皮细胞中PAI-1的分泌，同时减轻了TNF-α对TNFR1的抑制作用，从而改善肥胖、胰岛素抵抗及相关的心血管疾病的发生。

EGCG作为绿茶中的主要成分，近年来大量的研究表明，其具有清除自由基、抗脂质过氧化、抗突变、抗肿瘤、抗炎、抗病毒和增强机体免疫功能等多种生物学效应，对肥胖、糖尿病、抗动脉粥样硬化等多种疾病均具有明显的药理作用［5］。EGCG可减少内皮细胞中 MCP-1的表达［6］，而 MCP-1对单核细胞的招募作用在动脉粥样硬化的发生中起到了重要作用［7］。本研究结果表明EGCG可减少内皮细胞中PAI-1的表达，而PAI-1是动脉粥样硬化发生的独立危险因素［8］。这些数据均说明了绿茶对炎症性疾病尤其是动脉粥样硬化有保护作用［9］。

在内皮细胞中，ERK1／2活化是TNF－α作用于内皮细胞后的重要途径［10］。既往我们曾报道了TNF-α通过ERK1／2途径使内皮细胞中PAI-1表达增加［3］。在内皮细胞中 ERK1／2途径是与 PAI－1产生相关的重要信号转导途径。本研究中发现EGCG可通过ERK1／2途径抑制TNF-α诱导的PAI-1表达的水平。ERK1／2可以调节细胞的生长分化和增殖，还与动脉粥样硬化的改变密切相关［11］。抑制ERK1／2路径是可以达到保护心血管的效益的，但同时也可能扰乱正常细胞的生长分化和增殖，故目前尚不能应用于临床。

TNF-α作为一种炎症因子，通过它的受体TNFR1／TNFR2对胰岛素抵抗、心血管疾病的发生起着重要作用［12］。TNF-α可引起内皮细胞中TNFR1的重新分布和下调［13］。本研究应用的是人脐静脉内皮细胞研究，TNF-α可引起TNFR1的明显下调。Davidge等报道发现在牛冠状动脉内皮细胞中EGCG可减弱 TNF-α诱导的 TNFR1的下调［13］。与其结果相一致的是，本研究发现EGCG可阻抑人脐静脉内皮细胞中TNF-α对TNFR1的下调。EGCG对TNF-α抑制TNFR1表达的阻抑作用，表明EGCG可能通过TNFR1发挥着其减轻胰岛素抵抗、心血管疾病发生风险的作用［14］。

总之，本研究结果表明了EGCG在改善肥胖相关心血管疾病等并发症中的重要作用，这将为肥胖相关心血管疾病的治疗方法开辟了重要的途径。

［1］Nakatsuji H，Kishida K，Kitamura T，et al.Dysregulation of glucose，insulin，triglyceride，blood pressure，and oxidative stress after an oral glucose tolerance test in men with abdominal obesity.Metabolism，2010，59（4）：520-526

［2］Stanley TL，Zanni MV，Johnsen S，et al.TNF-alpha antagonism with etanercept decreases glucose and increases the proportion of high molecular weight adiponectin in obese subjects with features of the metabolic syndrome.J Clin Endocrinol Metab，2011，96（1）：E146-150

［3］Cao YL，Hu CZ，Meng X，et al.Expression of TNF-alpha protein in omental and subcutaneous adipose tissue in obesity.Diabetes Res Clin Pract，2008，79（2）：214-219

［4］Brown AL，Lane J，Holyoak C，et al.Health effects of green tea catechins in overweight and obese men：a randomised controlled cross-over trial.Br J Nutr，2011，106（12）：1880-1889

［5］Chen YK，Cheung C，Reuhl KR，et al.Effects of green tea polyphenol （-）-epigallocatechin-3-gallate on newly developed high-fat／Western-style diet-induced obesity and metabolic syndrome in mice.J Agric Food Chem，2011，59（21）：11862-11871

［6］Zheng Y，Toborek M，Hennig B.Epigallocatechin gallate-mediated protection against tumor necrosis factor-αinduced monocyte chemoattractant protein-1expression is heme oxygenase-1dependent.Metabolism，2010，59（10）：1528-1535

［7］Martinovic I，Abegunewardene N，Seul M，et al.Elevated monocyte chemoattractant protein-1serum levels in patients at risk for coronary artery disease.Circ J，2005，69（12）：1484-1489

［8］Ploplis VA.Effects of altered plasminogen activator inhibitor-1expression on cardiovascular disease.Curr Drug Targets，2011，12（12）：1782-1789

［9］Ramesh E，Geraldine P，Thomas PA.Regulatory effect of epigallocatechin gallate on the expression of C-reactive protein and other inflammatory markers in an experimental model of atherosclerosis.Chem Biol Interact，2010，183（1）：125-132

［10］Guitton C，Cottereau A，Gérard N，et al.Protective cross talk between activated protein C and TNF signaling in vascular endothelial cells：implication of EPCR，noncanonical NF-κB，and ERK1／2MAP kinases.Am J Physiol Cell Physiol，2011，300（4）：C833-842

［11］Tao R，Lu L，Zhang R，et al.Triptolide inhibits rat vascular smooth muscle cell proliferation and cell cycle progression via attenuation of ERK1／2and Rb phosphorylation.Exp Mol Pathol，2011，90（2）：137-142

［12］Deng H，Xue YM，Zhan XZ，et al.Role of tumor necrosis factor-alpha in the pathogenesis of atrial fibrillation.Chin Med J（Engl），2011，124（13）：1976-1982

［13］Ahn HY，Xu Y，Davidge ST.Epigallocatechin-3-O-gallate inhibits TNFalpha-induced monocyte chemotactic protein-1production from vascular endothelial cells.Life Sci，2008，82（17-18）：964-968

［14］D＇Alessio A，Al-Lamki RS，Bradley JR，et al.Caveolae participate in tumor necrosis factor receptor 1signaling and internalization in a human endothelial cell line.Am J Pathol，2005，166（4）：1273-1282