陈 硕，邱少富，夏力亮，王中强，刘 军，柳 楠，祝令伟，孙 洋，宋宏彬，冯书章

NDM－1最先报道于2010年8月11日，英国医学界宣称南亚出现了一种新型细菌，几乎对所有抗生素都有抗药性，被称为“超级细菌”。确切地说，NDM－1不是一种细菌，而是一种新发现的基因blaNDM－1编 码 的 金 属－β－内 酰 胺 酶 （metallo－β－lactamase，MBL）。因为首次病例是在印度新德里医院住过院的瑞士人体内发现，所以一些西方医学者把它叫做“新德里金属－β－内酰胺酶1（New Delhi metallo－β－lactamase－1，NDM－1）”。近来研究发现，携带编码blaNDM－1基因的耐药质粒不仅可以在细菌间转移，而且能使所在宿主菌成为可以耐受几乎全部抗生素的超级细菌［1］。携带此酶的菌株对青霉素类、头孢菌素类、头霉素类等β－内酰胺类和碳青霉烯类抗生素均耐药，仅对多黏菌素及米诺环素衍生物—替加环素敏感［2］。由于该基因多定位于质粒，容易通过接合性转导在不同细菌间传递，一旦病原菌获得该基因，也会产生多重耐药表型，其感染将变得更加难以治疗。据报道，新德里的这位病人就同时感染了携带blaNDM－1基因质粒的肺炎克雷伯氏菌和大肠杆菌［3］。目前，这种可移动元件携带的高水平广谱抗性的发展趋势引起国内外广泛关注。

本研究菌株NDM－1鲍曼不动杆菌分离自厦门某医院一肺癌病人，从其痰培养分离出多重耐药鲍曼不动杆菌，并检出NDM－1。本实验对该菌株的耐药谱进行测定，并对其blaNDM－1基因进行克隆、表达及序列分析，研究其耐药性的分子机制，为耐药基因的水平转移等研究奠定基础。

1 材料与方法

1．1 材料 NDM－1鲍曼不动杆菌、E．coli DH5α为本实验室保存；DL2000DNA Marker、质粒pMD18－T购自大连宝生物公司。凝胶回收试剂盒购自杭州维特洁生物公司；Vitek32微生物鉴定系统为法国梅里埃公司产品；美洛培南为浙江海正制药厂生产。

1．2 NDM－1鲍曼不动杆菌菌株鉴定与药敏实验 使用Vitek32微生物鉴定系统，以革兰阴性菌鉴定卡GNI＋进行菌株鉴定，药敏卡GNS－506进行耐药谱测定。

1．3 NDM－1鲍曼不动杆菌blaNDM－1基因的 PCR扩增与克隆 根据 GenBank的blaNDM－1基因（pKpANDM－1，登录号FN396876．1）编码序列设计两条引物 LE－F：5′－GGCGTTAGATTGGCTTACACCATTAGAG－3′和 LE－R：5′－CAGGCAACAGCCGAACGAGC－3′，引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。以NDM－1鲍曼不动杆菌基因组DNA为模板，按照以下条件扩增blaNDM－1基因：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸7min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。凝胶回收试剂盒纯化PCR产物，将其与pMD18－T载体于4℃过夜连接，再将连接产物转化至大肠杆菌E．coli DH5α，涂布于含氨苄青霉素（100μg／mL）的LB平板筛选。挑取单菌落培养后提取质粒进行EcoRI和HindIII双酶切鉴定，鉴定正确的重组质粒pMD18－T：：blaNDM－1送上海生物工程技术服务有限公司测序。

1．4 美洛培南对NDM－1鲍曼不动杆菌、重组E．coli DH5α（pMD18－T：：blaNDM－1）及大肠杆菌 E．coli DH5α最小抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC）的测定 将菌液过夜培养物稀释1 000倍，每孔100μL。美洛培南浓度从1孔至14孔分别为 128、64、32、16、8、4、2、1、0．5、0．25、0．125、0．062 5、0．031 25、0．015 625μg／mL，15孔不加药作为生长对照。密封，35℃温箱培养16～20h。判断标准以孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。

2 结 果

2．1 NDM－1鲍曼不动杆菌菌株鉴定与药敏结果Vitek32微生物自动鉴定仪鉴定此菌株为鲍曼不动杆菌。药敏结果见表1。

表1 NDM－1鲍曼不动杆菌厦门株药敏结果Tab．1 The antimicrobial susceptibility profile of NDM－1 Acinetobacter baumannii

2．2 NDM－1鲍曼不动杆菌blaNDM－1基因的PCR扩增、克隆与序列分析 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳见图1所示，结果扩增出了与预期大小一致的片段。blaNDM－1基因克隆到pMD18－T载体后进行双酶切鉴定。酶切产物电泳检测结果如图2所示，说明blaNDM－1基因已克隆到载体中。

图1 PCR扩增 NDM－1（厦门株）blaNDM－1基因Fig．1 Amplification of blaNDM－1M：DL2000DNA Marker；1：PCR products

测序结果与香港分离的大肠杆菌HK－01质粒pNDM－HK及印度肺炎克雷伯氏菌 KP－05－506质粒pKpANDM－1携带的blaNDM－1基因进行Blast序列比对。结果显示，NDM－1鲍曼不动杆菌与HK－01的blaNDM－1基因序列同源性为100%；与 KP－05－506相比，在blaNDM－1和trpF之间有24bp的插入，这一段插入的序列除了存在于香港HK－01株外，还存在于 NDM－1大肠杆菌 DVR22（西班牙株）、NDM－1大肠杆菌271（澳大利亚株）、NDM－1铜绿假单胞菌（塞尔维亚株）、NDM－1鲍曼不动杆菌161／07（德国株）和 NDM－1大肠杆菌 Dok01（日本株），该段序列均位于blaNDM－1基因下游，功能未知。序列比对结果如下。

图2 EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定重组质粒pMD18－T：：blaNDM－1Fig．2 Identification of plasmid pMD18－T：：blaNDM－1by restriction enzyme digestionM：DL2000DNA Marker；2：plasmid fragments digested by EcoRI and HindⅢ

2．3 最小抑菌浓度的测定 美洛培南对NDM－1鲍曼不动杆菌、E．coli DH5α（pMD18－T：：blaNDM－1）及大肠杆菌E．coli DH5α最小抑菌浓度的测定结果为NDM－1鲍曼不动杆菌厦门株：128μg／mL；E．coli DH5α（pMD18－T：：blaNDM－1）：32μg／mL；E．coli DH5α：0．03125μg／mL。

3 讨 论

金属－β－内酰胺酶基因可通过染色体和转移基因在不同细菌间传递，造成广泛耐药，多种重要的获得性 MBLs（IMP，VIM，SPM，GIM，SIM）都是由质粒介导和可转移基因编码［4］。获得性 MBLs不仅分布于肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌和不动杆菌中，还可通过质粒或整合子在不同菌株、种属间传播［5］，因此产获得性MBLs的革兰阴性杆菌被公认为极其重要的多重耐药病原体［6］，给感染性疾病的临床治疗带来严峻的挑战。

药敏实验结果显示，本研究NDM－1鲍曼不动杆菌对青霉素类、头孢菌素类、头霉素类等β－内酰胺类和碳青霉烯类抗生素均耐药，对氨基糖苷类抗生素及喹诺酮类抗生素敏感。β－内酰胺类是处理严重传染病中主要的抗生素，与碳氢霉烯类抗生素协同应用效果更好，由于碳氢霉烯类在传染病治疗上大量使用，是导致超广谱β－内酰胺酶在肠杆菌科细菌产生和扩散的主要原因［6］。

本实验将NDM－1鲍曼不动杆菌编码碳青霉烯酶的blaNDM－1结构基因及其上下游调控序列克隆转化至大肠杆菌E．coli DH5α。序列分析结果表明，该菌株blaNDM－1基 因 与 NDM－1 大 肠 杆 菌 香 港 株blaNDM－1基因序列同源性为100%，其结构基因与NDM－1克雷伯氏菌印度分离株同源性也是100%，但在blaNDM－1结构基因的下游和trpF之间有24bp的插入片段。这段24bp的插入片段至少在耐药基因溯源上具有重要价值，还极有可能具有特殊的生物学意义，值得深入研究。

野生菌株及重组菌株对美洛培南（碳青霉烯类抗生素）最小抑菌浓度测定结果显示，获得了blaNDM－1基因的E．coli DH5α重组菌株对美洛培南的MIC升高了256倍，证明了blaNDM－1基因是碳青霉烯类抗生素耐药性产生的分子基础。E．coli DH5α（pMD18－T：：blaNDM－1）对美洛培南的 MIC值仍然比NDM－1鲍曼不动杆菌低4倍，可能的原因是该株NDM－1鲍曼不动杆菌还存在其他耐药机制，能够协同抵抗此类抗生素的作用。

鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii，Ab）是不动杆菌属中最常见的一种革兰阴性球杆菌，属于条件致病菌，常常引起医院相关感染［7］。从医院环境分离的鲍曼不动杆菌，往往对多种抗生素耐药，常被称为“革兰氏阴性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Gram－negative MRSA）”［8］。 因 此，这 些 获 得 了NDM－1质粒的鲍曼不动杆菌，可使医院发生相关感染的危害程度增加，治疗更加困难。由于blaNDM－1基因在多种肠杆菌科细菌中被发现［9］，说明此基因可以在不同细菌间转移，这样就可能使得更多的细菌携带此基因。因此，携带blaNDM－1基因的细菌有可能给人类造成重大的健康威胁。

［1］孙明伟，郑焙文，高福，等．人类与病原菌的军备竞赛：NDM－1耐药基因与 超 级 细 菌 ［J］．生 物 工 程 学 报，2010，26（11）：1461－1472．

［2］Rose WE，Rybakh MJ．Tigecyeline：first of new class of antimicrobial agents［J］．Phannacotherapy，2006，26（8）：1099－1110．

［3］Yong D，Toleman MA，Giske CG，et al．Characterization of new metallo－beta－lactamase gene，bla（NDM－1），and a novel erythromycin esterase gene carried on a unique genetc structure in Klebsiella pneumonia sequence type 14from India［J］．Antimicrob Agents Chemother，2009，53（12）：5046－5054．

［4］Samuelsen O，Castanheira M，Walsh TR，et al．Kinetic charac－terization of VIM－7，a divergent member of the VIM metallo－beta－lactamase family［J］．Antimicrob Agents Chemother，2008，52（8）：2905－2908．

［5］Murphy TA，Simm AM，Toleman MA，et al．Bioch emical Characterization of the Acquired Metallo－beta－Lactamase SPM－1 from Pseudomonas aeruginosa［J］．Ant imicrobial Agents and Chemotherapy，2003，47（2）：582－587．

［6］Lee K，Yum J H，Yong D，et al．Novel acquired metallo－betalactamase gene，blaSIM－1，in a class 1integron from Acinetobacte r baumannii clinical isolates from Korea［J］．Antimicrob A－gents Chemother，2005，49（11）：4485－4491．

［7］Sobel JD．Pathogenesis and treatment of recurrent vulvovaginal candidiasis［J］．Clin Infect Dis，1992，14（Suppl1）：S148－153．

［8］Nalbanski B，Tsekova K，Ivanov S．Candidiasis and birth canal in Juries［J］．Akush Ginekol（Sofiia），2002，41：23－25．

［9］Centers for Disease Control and Prevention（CDC）．Detection of Enterobacteriaceae isolates carrying metallo－beta－lactamase－United Statea［R］．MMWR Wkly Rep，2010，59（24）：750．