李 鹏，宋楠楠，岳盈盈，李志会，张 颖，盖中涛，孟 红

肠道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）是引起婴幼儿手足口病（Hand Foot and Mouth Disease，HFMD）的主要病原之一，其感染可导致部分患者无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿、脊髓灰质炎样瘫痪等神经系统并发症，死亡率较高［1］。我国2008年安徽阜阳出现EV71手足口病暴发，近几年各地的手足口病疫情不断加剧［2］。目前重症EV71手足口病的嗜神经性致病机制仍不明确，EV71毒力决定因子也未确定，给EV71的防治带来很大困难。为探讨序列变异对EV71流行和毒力变化的影响及目前济南流行株的遗传学背景，本研究对济南市两株分别源自轻症和重症手足口病人的EV71分离株进行全基因组序列的测定和比较分析，为EV71致病机制和嗜神经性毒力位点的研究提供参考。

1 材料与方法

1．1 毒株 EV71JN200803株，分离自2008年济南市传染病医院仅患有皮疹的手足口病患者粪便标本，接种1日龄BALB／c小鼠无明显临床症状；EV71JN200804株，分离自2008年济南市传染病医院患有无菌性脑膜炎手足口病患者的粪便标本，接种1日龄BALB／c小鼠可导致后肢麻痹，死亡。

1．2 试剂 RNA提取采用德国QIAGEN公司病毒RNA提取试剂盒（QIAamp Viral RNA Mini Kit），cDNA第一链合成试剂盒（QuantScript RT Kit）、高保真DNA聚合酶（Pfu DNA Polymerase）及凝胶DNA回收试剂盒（TIANgel Midi Purification Kit）均购自天根生化科技（北京）有限公司。

1．3 引物 根据EV71安徽阜阳株（EU703812）并参考BrCr株全基因组序列，利用Primer5．0设计扩增EV71全基因组核苷酸序列引物，9对引物首尾相互重叠、覆盖全基因组，见表1。

表1 PCR扩增用引物序列Tab．1 Primers used in PCR amplification

1．4 病毒总RNA的提取 把EV71JN200803、JN200804株经MA104细胞扩增得到的细胞培养物反复冻融3次，12 000g离心5min，取上清液140μL按RNA提取试剂盒的说明书进行操作。

1．5 RT－PCR 采用cDNA第一链合成试剂盒，将病毒总RNA逆转录成cDNA，取逆转录反应产物于25μL反应体系中进行PCR反应。PCR反应条件：94℃3min；94℃30s，N 30s，72℃1min，40 Cycles（N为退火温度，各引物不同）；72℃10min。PCR扩增的特异性片段经1%琼脂糖凝胶电泳分离，回收后送公司测序、拼接。

1．6 全基因组序列的比对 采用clustalx1．83对EV71JN200803和JN200804的核苷酸和氨基酸序列进行比对，找出两株病毒在核苷酸和氨基酸序列上的差异。

1．7 非编码区的二级结构分析 采用RNAstructure5．3对EV71JN200803和JN200804株5′UTR和3′UTR的二级结构进行预测，并对其差异进行分析。

1．8 遗传进化分析 采用 MEGA5．05软件对EV71JN200803和JN200804株进行遗传进化分析，将其与国内外各型EV71毒株的发育关系进行研究。

2 结 果

2．1 全基因组序列测定分析 不包含多聚腺苷酸尾EV71JN200803株全基因组长度为7 405nt，EV71JN200804株全基因组长度为7 404nt。JN200803株 5′端非编码区（5′UTR）为 742nt，JN200804株为741nt；两毒株基因组编码区均为6582nt，编码2193个氨基酸的多聚蛋白（Polyprotein）；3′端非编码区（3′UTR）均为81nt。JN200803和JN200804株病毒基因组的组成和结构均符合EV71的特征。测定的全基因组序列已上传至GENEBANK，EV71JN200803和JN200804株的序列登记号分别为：JF913464和HQ825317。

2．2 两株EV71核苷酸和氨基酸序列差异分析EV71JN200803和JN200804株非编码区核苷酸序列比较发现，5′UTR共有7个核苷酸的差异，除99位JN200804株缺失1个胞嘧啶核苷酸（C）外，其余6个均为核苷酸的转换；3′UTR只有7347位1个核苷酸的发生转换，见表2。EV71JN200803和JN200804株编码区核苷酸及氨基酸序列比较发现，二者在编码区没有核苷酸的缺失和插入，共有98个核苷酸的差异，且突变类型全都属于转换，但大部分核苷酸的突变属于同义突变，仅有16个造成了氨基酸的改变；16个突变氨基酸的分布为，VP3 3个，VP1 1个，2A1 个，2B3 个，2C4 个 ，3C2 个 ，3D2个，而VP4、VP2、3A和3B氨基酸没有发生突变，表3。

表2 两株EV71非编码区序列比较结果Tab．2 Comparision of noncoding regions in JN200803 and JN200804

表3 两株EV71编码区序列比较结果Tab．3 Comparision of the coding regions in JN200803and JN200804

2．3 两株EV71非编码区二级结构差异分析EV71 5′UTR第453～561位碱基（BrCr株碱基位置）区与脊髓灰质炎病毒的内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site，IRES）第Ⅵ结构域相对应，该区被认为同脊髓灰质炎病毒（poliovirus）的毒力密切相关［3］。然而EV71JN200803和JN200804株在此区核苷酸序列完全相同，表明造成二者毒力差别的毒力决定位点可能并不在5′UTR。采用RNAStructure5．3对3′UTR进行了RNA二级结构预测。从图1可以看到EV71JN200803和JN200804株二级结构仅3′UTR第23位（基因组7347位）与第52位（基因组7376位）碱基配对有差异，JN200803的 G－T不能形成稳定的配对，而JN200804的A－T的配对很稳定。JN200804株形成二级结构所需自由能低于JN200803株，毒力较强的JN200804株的二级结构更稳定。

图1 JN200803和JN200804株3′UTR二级结构预测Fig．1 Computer－predicted secondary structures of EV71 3′UTR of JN200803and JN200804Note：ΔG of JN200803and JN200804were﹣25．4 kcal／mol and﹣25．8kcal／mol，respectively

2．4 两株EV71的遗传进化分析 采用MEGA5．05软件，通过邻接法（Neighbor－joining），以柯萨奇病毒A16型（coxsackievirus A16，CVA16）为外群，对EV71JN200803、JN200804及GenBank中各亚型EV71的VP1及全基因组核苷酸序列进行遗传进化分析（图2，图3）。可见JN200803和JN200804株与Fuyang／17．08／1株进化关系最近，同属于C4基因亚型的C4a进化分支。2008年国内主要的EV71流行株进化关系非常密切，与国外EV71毒株进化关系较远。

3 讨 论

图2 EV71VP1区的遗传进化分析Fig．2 Phylogenetic tree of VPl regions in EV71

图3 EV71全基因组核苷酸序列的遗传进化分析Fig．3 Phylogenetic tree of complete genomic nucleotide sequences in EV71

EV71进化过程中的基因突变是造成毒力改变的主要因素之一。McMinn等［4］发现EV71澳大利亚流行株中只表现HFMD与具有神经毒性分离株的主要区别在于VP1第170氨基酸从丙氨酸（Ala）突变 为 缬 氨 酸 （Val）。Fujimoto 等［5］发 现 日 本Hyogo地区表现为脑干脑炎EV71毒株的VP4基因序列均一致，与表现为手足口病EV71毒株有较大差异。Shih等［6］比较了致死和非致死病例感染的EV71的基因组全序列，发现非结构蛋白3C区域的核苷酸序列存在较大差异。Chang等［7］对中国6株不同毒力EV71分离株全基因组序列分析发现，3株临床轻症分离株与3株临床重症分离株唯一相同的差别是第1994位氨基酸（3D区）由缬氨酸（Val）突变为异亮氨酸（Ile）。Wang等［8］将实验鼠感染不致病EV71毒株4643与具有神经嗜性突变毒株MP4进行全基因组序列分析，结果MP4 5′UTR区有4个核苷酸突变。

本文两株不同毒力EV71的全基因组序列比较发现，编码区有16个氨基酸发生了突变，其中VP3 3个，VP1 1个，2A1个，2B3个，2C4个，3C2个，3D2个，而VP4、VP2、3A和3B氨基酸未发生突变。其中3D区的突变与中国其他省EV71轻重株（重株：安徽1株、河南2株，轻株：重庆3株）氨基酸突变不同［7］，JN200803和JN200804株第1994位氨基酸均为异亮氨酸（Ile），与重庆的3株轻株相同。VP3、2A、2B和2C区虽然在已有报道中不是常见的毒力决定区域，但也可能存在对病毒毒力有影响的位点，Whitton等［9］发现脊髓灰质炎病毒VP3第91位氨基酸对病毒致病性具有重要意义。因而EV71毒力决定位点不但具有非单一性，而且具有明显的区域独特性，与当地的流行特点密切相关。

小 RNA 病毒科 （picornaviridae）病 毒 的5′UTR有一个与翻译密切相关的IRES，EV71与脊髓灰质炎病毒的IRES为同一类型，结构与功能极为相似［10］。脊髓灰质炎病毒IRES的第Ⅵ结构域被认为与其毒力密切相关，而JN200803和JN200804株在此区域核苷酸序列完全相同，可见EV71济南分离株的毒力决定位点可能不在5′UTR。EV71 3′UTR被认为与病毒负链合成相关，对病毒基因组的转录和复制有重要的调控作用，而EV71 JN200803和JN200804株3′UTR只有一个核苷酸的不同，分析发现JN200804株的二级结构更稳定，对病毒基因组的转录和复制更为有利。

通常认为VPl区全长核苷酸序列分析可作为肠道病毒属血清型分类的依据［11］。本文将EV71济南分离株与2008年国内主要流行株及其他亚型EV71进行了VP1和全基因组遗传进化分析，发现两株EV71济南分离株同属C4亚型的C4a进化分支，与Fuyang／17．08／1株进化关系最近，应具有共同的起源。另外，中国大陆1998年以来的EV71毒株均为C4亚型，2008年的分离株均为C4亚型的C4a进化分支；与国外病毒株相比，中国大陆EV71分离株与中国台湾分离株的亲缘关系更近。总之，对相同疫源中不同毒力EV71分离株（EV71 JN200803和JN200804株）的全基因组序列进行比较，发现潜在的毒力决定位点，分析EV71的变异情况和流行特点，对EV71手足口病的防治具有重要意义。

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