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银耳多糖的抗肿瘤作用及其机制*

2011-12-08韩英徐文清杨福军沈秀洪阁黄洁周则卫

医药导报 2011年7期
关键词:基因芯片银耳多糖

韩英,徐文清,杨福军,沈秀,洪阁,黄洁,周则卫

(中国医学科学院放射医学研究所,天津市分子核医学重点实验室,天津 300192)

银耳(Tremella fuciformis Berk)又称白木耳,为常用保健品,其主要化学成分为银耳多糖[1-2]。大量实验研究表明,银耳多糖具有抗辐射[3]、抗氧化[4]、增强免疫力[5]、升高白细胞、降血糖以及抗肿瘤等作用[6]。研究表明,药物抗肿瘤作用的机制与增强免疫和诱导凋亡等有关[7]。为了进一步开发银耳多糖的药用价值,研究其抗肿瘤作用的机制,笔者从银耳孢子发醇粉中提取、分离得到了一种均一体银耳孢子多糖,观察其对小鼠H22肝癌的抑制作用,用基因芯片技术初步探讨银耳多糖抑制肝癌的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 银耳多糖(相对分子质量为68 000,中国医学科学院放射医学研究所药物室从银耳孢子发酵粉中提取、分离得到的均一体多糖),香菇多糖(福州梅峰制药厂,批号:041201),氟尿嘧啶(南通海尔斯药业有限公司,批号:20040301),顺铂(云南生物谷灯盏花药业有限公司,批号:20040701),H22肝癌细胞株(天津市医药科学研究所)。昆明种小鼠,体质量18~22 g,雌雄兼用,军事医学科学院动物室,许可证号:SCXK-(军)2002-001。芯片类型:BiostarM-40s,上海联合基因科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 荷H22肝癌小鼠模型的建立 100只实验小鼠,每只左腋窝皮下接种瘤细胞悬液0.2 mL,活细胞数为1×106。

1.2.2 分组与给药 接种后随机分为药物组和对照组,药物组分高、中、低3个剂量组,于接种后第2天分别腹腔注射银耳多糖12,6和1 mg·kg-1,间隔2 d给药1次,共给药3次,阳性药(顺铂、香菇多糖)采用相同给药方式,对照组只给予0.9%氯化钠溶液。为了比较给药方式对肿瘤的抑制作用,设银耳多糖连续给药组(给药10次)。基因芯片实验用肿瘤组织,每组选取6 mg·kg-1作为样本。

1.2.3 疗效评价 停药24 h处死小鼠,称定体质量,解剖,剥离瘤块,称瘤质量。肿瘤抑制率=(对照组平均瘤质量-给药组平均瘤质量)/对照组平均瘤重×100%。基因芯片实验用肿瘤组织放置在液氮罐中保存。

1.2.4 总RNA的提取及纯化 取冻存的实验组(15只)和对照组(15只)肿瘤组织,按组别用组织匀浆机分别混匀,用UNIzol试剂抽提肿瘤组织的总RNA,紫外分析及电泳检测。用OligotexmRNA Midi试剂盒纯化mRNA。

1.2.5 探针标记 逆转录标记cDNA探针并纯化。用Cy5-dUTP和Cy3-dUTP标记实验组和对照组肿瘤组织的mRNA,经乙醇沉淀后溶解在杂交液中。

1.2.6 芯片杂交与荧光扫描 将基因芯片和杂交探针置于95℃水浴中变性2 min;将探针置于芯片上,用盖玻片覆盖,置于杂交舱中,用Parafilm密封,放入42℃杂交箱内杂交过夜(16~18 h)。然后去除盖玻片,洗涤、晾干。用Scan Array 4000扫描仪扫描芯片,Gene Pix Pro 3.0图像处理软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值,基因差异表达标准:Cy5和Cy3的比值<0.5为表达下调,0.5~2.0表示差异无统计学意义,>2.0表达上调。

1.2.7 统计学方法 采用SPSS11.0统计软件进行,多组间比较用One-Way ANOVA检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 银耳多糖抑制小鼠H22肝癌实验 顺铂对小鼠H22肝癌具有明显的抑制作用。香菇多糖和银耳多糖对H22肝癌均具有一定的抑制作用,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。但顺铂影响小鼠的生长,使其体质量减轻。相反,香菇多糖和银耳多糖可促进小鼠体质量增加,与对照组比较,体质量增加明显。见表1。银耳多糖对荷H22肝癌小鼠肝、脾、胸腺指数的影响见表2。结果表明,顺铂可明显伤及小鼠的肝、脾、胸腺等器官,使其萎缩。相反,香菇多糖和银耳多糖可促使小鼠肝、脾、胸腺等器官有一定程度的增长。因为脾、胸腺为免疫器官,因此可见,香菇多糖和银耳多糖可促进小鼠免疫功能的增强。

2.2 总RNA电泳分析 抽提出的样品和对照的总RNA通过电泳,进行纯度分析。结果如图1。结果表明,RNA样本的A260/A280的比值为1.9~2.0,总RNA电泳图谱有清晰的28S,18S条带证明抽提得到高纯化的总RNA,可以用于基因芯片研究。

2.3 芯片检测结果 本实验结果经Scan Array 4000扫描仪扫描,用BiostarM-40s图像处理软件:Gene Pix Pro 3.0处理扫描结果,用Cy5/Cy3信号比值判定结果。结果见图2。图中,X轴、Y轴分别以Cy3和Cy5荧光强度值(前景值-背景值)和荧度值为坐标,每一个数据点代表芯片上一个基因点的杂交信号;数据点若为红色,则代表Y值与X值的比值在0.5~2.0,基本属非差异表达;数据点若为黄色,则代表Y值与X值的比值<0.5或>2.0,该点很可能属于表达差异。分析结果表明,共有324数据点为黄色,表明有324个基因有表达差异。其中表达上调基因185个,表达下调基因139个。因为差异表达基因数量太多,不再具体列出基因编号和强度比值。

3 讨论

在抑制H22肝癌实验中,连续给药组抑制肿瘤效果不如间隔给药组,原因可能是银耳多糖作为免疫调节剂发挥抗肿瘤作用,连续给药会造成免疫麻痹,从而使抑瘤效果降低。

表1 7组小鼠H22肝癌抑制实验结果Tab.1 The inhibition effect of H22 hepatoma ofm ice in seven groups ±s

表1 7组小鼠H22肝癌抑制实验结果Tab.1 The inhibition effect of H22 hepatoma ofm ice in seven groups ±s

与对照组比较,*1 P<0.01,*2 P<0.05Compared with control group,*1 P <0.01,*2 P <0.05

组别 剂量/(mg·kg-1)小鼠/只给药次数/次体质量增长 瘤质量g抑瘤率/%银耳多糖低剂量组 1 10 3 6.82±2.33*1 1.66±1.09*1 59.0中剂量组 6 10 3 7.20±1.52*1 1.12±0.76*1 72.3高剂量组 12 10 3 6.27±1.93*2 1.77±1.04*1 56.3连续给药组 12 10 10 5.51±3.04 2.18±1.41*1 46.2香菇多糖组 1 10 3 7.93±2.55*1 1.50±1.17*1 63.0顺铂组 5.3 10 3 -4.49±1.75*1 0.93±0.15*1 90.4对照组 … 10 … 3.20±3.18 4.05±1.27…

表2 7组荷瘤小鼠肝、脾、胸腺指数比较Tab.2 The comparisons of liver,spleen and thymus index of tunor-bearingm ice in seven groups mg·g-1,±s

表2 7组荷瘤小鼠肝、脾、胸腺指数比较Tab.2 The comparisons of liver,spleen and thymus index of tunor-bearingm ice in seven groups mg·g-1,±s

与对照组比较,*1 P<0.05,*2 P<0.01Compared with control group,*1 P <0.05,*2 P <0.01

组别 剂量/(mg·kg-1)小鼠/只给药次数/次肝指数 脾指数 胸腺指数银耳多糖低剂量组 1 10 3 25.2±4.0 15.74±3.62 4.08±0.99*1中剂量组 6 10 3 24.3±4.7 14.89±3.41 4.55±0.97高剂量组 12 10 3 22.5±3.4 16.06±4.08 4.84±1.11*1连续给药组 12 10 10 23.3±2.6 17.31±2.88 4.44±1.48香菇多糖组 1 10 3 24.7±2.8 16.32±3.17 3.04±0.58顺铂组 5.3 10 3 9.8±1.9*2 3.36±1.34*2 1.65±0.54*2对照组 … 10 …22.7±6.3 13.44±4.60 3.61±0.91

不同组织样本(对照组/实验组)杂交信号强度散点图,只是一个示意图,表明在基因芯片上表达差异基因与非差异表达基因的数量,具体基因的变化在图1中表现不出来。通过追踪文献以及与功能基因芯片信息的比对分析,可以将这些表达差异基因分为以下几个方面。①信号转导基因,如:钙信号分子基因,信号转导蛋白基因,JAK-STAT通路基因,应激/热休克通路基因等。②干细胞和分化细胞的分子标志基因,如:GOLLI-MBP/HMBPR, LC1/MAP5, Tubb3, Actc1,GREMLIN2/PRDC。③细胞因子、转录因子基因,如:DISM2/PPP1C,GABPA。④细胞基质和细胞粘连相关基因,如:COL3A-1/MMS10-W,DC/DSPG2。⑤转运和泵基因,如:SUR2/SUR2A,ANT2,ATP5B。⑥乳腺癌直接相关基因,如:RAC2,24P3/NGAL。⑦p53上游信号/p53调节剂基因,p53信号通路基因,如:CSNK1A,BETA/REV-ERB。⑧DNA损伤检测/p53和ATM通路基因,如:TI-225,ABL/C-ABL。⑨抗原递呈基因,如:CD1A/CD1D。⑩化疗应答相关基因,如:9630030H21。○11 G1 期基因,如:Rbl2,CRK3。

在用基因表达芯片研究银耳多糖抑制肿瘤作用的机制中,发现324个表达差异基因,在这些表达差异的上调/下调基因中,许多是与银耳多糖增强免疫和抗肿瘤作用相一致的。如抗原呈递基因(如CD1A/CD1D)表达上调,可以增强免疫系统对肿瘤的杀伤作用。化疗应答相关基因(如9630030H21)表达上调,可以增强肿瘤组织对化疗药物的敏感性,提高化疗药物对肿瘤杀伤作用。DNA损伤检测/p53和ATM通路基因(如TI-225、ABL/C-ABL)和G1期基因(如Rbl2、CRK3)均表达上调,具有异曲同工的作用。p53蛋白在细胞生长调节中具有重要作用,特别是在G1期调控点中的调节作用,它能抑制细胞生长,使被抑制细胞停留在G1期。研究表明,p53阻抑细胞于G1期,可能与影响相关的基因转录和DNA修复事件有关[8]。当细胞内存在DNA损伤时,有两个检查点控制细胞周期进程。其中,G1/S期及S期的检查点阻止损伤了的DNA进入S期进行复制,这样就避免新合成的DNA将损伤固定下来,防止损伤的DNA进行复制。终止DNA复制,细胞被停滞在G1期,这样就能够有足够的时间使损伤的DNA得以完成修复,从而避免错误信息的转录,控制基因突变过程,保证遗传性能的稳定性。如果DNA损伤不能得到有效修复,则p53也可诱导编程性细胞死亡[9]。

银耳多糖体内抑制肿瘤作用也是其进入体液后,作用于体内一系列的调控系统,调节相关基因的表达,发挥其肿瘤抑制效应的结果。表达谱基因芯片是用于基因组功能研究的一种应用型芯片,在功能基因组学研究中发挥广泛的作用[10]。本研究采用基因芯片分析手段,具有高通量和快速等优点。筛选得到了大量与肿瘤发生、发展和理化治疗相关的差异表达基因。通过对这些差异基因的进一步研究,有希望找到银耳多糖治疗肿瘤的新的药物作用靶点,同时,还可以发现银耳多糖其他作用靶点,拓展其临床应用范围,以期发挥更大的经济和社会效益。

[1] 徐文清,高文远,王雪姣,等.银耳孢子多糖TFA结构的研究[J].中草药,2008,39(8):1140-1142.

[2] 徐文清,王雪姣,黄洁,等.银耳碱提孢子多糖A-BTF的分离及结构分析[J].天然产物研究与开发,2007,19(6):1055-1058.

[3] 徐文清,沈秀,周则卫,等.银耳多糖对放射和化学损伤小鼠造血功能的保护作用[J].中草药,2006,37(7):1057-1058.

[4] 沈卫,曲丹,蔡东联,等.银耳多糖对半乳糖所致衰老小鼠抗氧化能力的影响[J].中华临床营养杂志,2009,17(3):158-160.

[5] 侯建明,王爱东,雷清新,等.银耳多糖对免疫功能影响的实验报告[J].中国疗养医学,2007,16(11):641-643.

[6] 陈飞飞,蔡东联.银耳多糖的主要生物学效用研究进展[J].中西医结合学报,2008,6(8):862-866.

[7] 李璐,毕富勇,吕俊.银耳多糖诱导肝癌HepG-2细胞凋亡的研究[J].实用医学杂志,2009,25(7):1033-1035.

[8] 汪堃仁,薛绍白,柳惠图.细胞生物学[M].北京:北京师范大学出版社,2000:501-508.

[9] 夏寿萱.放射生物学[M].北京:军事医学科学出版社,1998:245-248.

[10] 徐伟文,李文全,毛裕民.表达谱基因芯片[J].生物化学与生物物理进展,2001,28(6):822-826.

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