吴利云，罗冬娇，童夏生，阮正英，王恩智，陈豪

(1.浙江省台州市中西医结合医院泽国院区，317523;2.杭州师范大学钱江学院，310012)

缺血-再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury，IRI)是指细胞因缺血发生可逆性、可存活的损伤，在缺血纠正后这种损伤反而加重并引起细胞死亡或进一步的功能障碍。细胞凋亡是心肌IRI发生的重要机制之一，是心肌受损、心力衰竭发展的重要因素。体外实验证明腺病毒过度表达激活的RhoA作用于Rho激酶可导致心肌细胞肥大，继而促发细胞凋亡［1］。笔者研究心肌IRI大鼠模型，探讨Rho激酶在缺血-再灌注心肌细胞中是否有促凋亡作用，以及葛根素(Puerarin)对Rho激酶水平的影响，从而为心肌IRI的治疗及中药在临床使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠45只，购于温州医学院实验动物中心，动物证号:SCXR(浙)2005-0019，清洁级，体质量250～350 g，7～10周龄。饲养于恒温、净化、通风动物房，自由进食和饮水，室温保持(25±2)℃。

1.2 试剂 葛根素注射液(浙江康恩贝制药股份有限公司产品，批号:060102)，细胞凋亡检测试剂盒和TUNEL试剂盒(购于晶美生物工程有限公司)。兔抗P2MYPT1(Thr850)抗体(Upstate公司)，兔抗β-actin抗体(Santa cruz公司)，辣根酶标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物公司)，ECL试剂(Santa cruz公司)。流式细胞仪(FACS Calibur，Becton Dickinson公司)。

1.3 方法

1.3.1 动物分组与给药 45只SD大鼠随机分为3组:空白对照组、模型对照组和药物治疗组，每组15只。术前12 h禁食不禁水。空白对照组旷置左冠状动脉前降支30 min;而模型对照组和药物治疗组用血管夹夹闭左冠状动脉前降支30 min，再灌注2 h。空白对照组和模型对照组于术前30 min分别经股静脉输注0.9%氯化钠溶液2 mL·(100 g)-1，而药物治疗组于术前30 min经股静脉注射葛根素注射液0.05 g。术毕处死，取心尖以上缺血梗死区横切3 mm厚心肌组织，去离子水漂洗3次，用现配多聚甲醛液固定。

1.3.2 动物模型的制作 采用改进方法造模再灌注，造模方法参照文献［2］:大鼠用戊巴比妥钠麻醉后，气管切开接动物呼吸机，呼吸频率60次·min-1，潮气量2 mL·(100 g)-1。用止血钳游离大鼠左侧的胸大肌，暴露左第2，3，4 肋，分别在左第2，3，4肋间隙距离胸骨左缘约0.5 cm处进针穿线，每个肋间隙同一进针点穿两根0号手术线约40 cm，再将两根线用力拉向两侧，分开肋间肌和软组织并结扎肋间动脉，留取结扎线的剩余部分，将两根结扎线剩余部分用力拉向两侧拉开胸腔，并固定之。充分暴露心脏及其表面的血管，剪开心包膜，结扎冠状动脉前降支，结扎之前在预结扎的冠状动脉前降支处放置一根长约0.5 cm直径1.5 mm的乳胶管，打一个活结结扎，以备进行反复多次IRI实验。灌脉结扎成功标志:结扎线远端心肌颜色发绀，心电图Ⅱ导联上ST段弓背上抬0.1 mV和(或)T波高耸为完全结扎标志。再灌注损伤模型成功标志:缺血部位心肌颜色恢复，抬高的S-T段下降＞50%。

1.3.3 指标测定 ①电镜观察组织超微改变:取心尖以上缺血梗死区横切心肌厚3 mm，2.5%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，环氧树脂包埋切片，铅/铀染色。

1.3.4 TUNEL法检测细胞凋亡 取各组心肌组织，用4%甲醛固定，石蜡包埋，切片，采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡。具体步骤按试剂盒要求进行。以不加TUNEL反应混合物作阴性对照。结果的判定以背景无颜色、细胞核内着棕黄色颗粒为阳性细胞。凋亡指数按文献［3］计算。

1.3.5 流式细胞仪检测 0.25%胰蛋白酶消化细胞，1 000 r·min-1(离心机半径10 cm)离心5min去除培养基，磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution，PBS)洗涤1次，弃上清液，收集细胞。PBS 100μL重悬细胞，分别加入Annexin VFITC试剂5μL和20μg·μL-1碘化丙啶(propidium iodide，PI)溶液10μL，室温中避光孵育15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.3.6 细胞内钙离子(Ca2+)浓度测定 采用原子吸收分光光度法测定。

1.3.7 Western blot法检测Rho激酶蛋白表达 每瓶细胞加入放射免疫沉淀测定(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液和苯甲基碘酰氟(phenylmethyl sulfonyl fluoride，PMSF)1 mL，冰上裂解60 min，再将裂解细胞吸入1.5 mL Ep管，12 000 r·min-1(离心肌半径10 cm)离心15 min(4℃)，留取上清液。考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。按每孔蛋白20μg上样行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，用转移缓冲液把凝集上蛋白质转移至硝化纤维素(nitrocellulose，NC)膜上(Pall公司)，丽春红染色检测蛋白转印是否完全，膜在室温下用50 g·L-1脱脂奶奶粉封闭液封闭1 h，加入兔抗磷酸化下游底物1(myosin phosphatase target subunit1，PMYPT1)(Thr850，1∶1 500)抗体，4 ℃孵育12 h。洗膜3次，每次5 min。辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1∶1 000)室温孵育1 h，洗膜3次，每次5 min，加入电致化学发光(electrochemiluminescence，ECL)发光液显色曝光1～2 min，用化学发光试剂盒检测杂交信号，以β-actin作内参，用数码成像分析系统软件对Western blot结果进行定量分析，吸光度值表示蛋白相对表达量。

1.3.8 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件处理数据，所得计量资料用均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 透射电镜观察结果 空白对照组:心肌细胞无水肿，肌小节明暗带清晰，线粒体无肿胀，嵴突规则致密，核膜完整无皱缩，染色质疏松、密度均一;模型对照组:心肌细胞明显水肿，线粒体肿胀，嵴明显减少或消失，肌丝断裂;肌小节明暗带模糊不清，肌丝断裂溶解，部分细胞核染色质凝集成块呈凋亡改变，偶见凋亡小体;药物治疗组:线粒体包膜完整、嵴密集。肌小节等长，各带清晰;核膜完整轻度皱缩，染色质浓缩趋边、呈点状分布。凋亡细胞明显减少。

2.2 细胞内Ca2+浓度的检测结果 心肌细胞IRI后胞内Ca2+浓度明显高于空白对照组，药物治疗组胞内Ca2+浓度比模型对照组显著降低(P＜0.01)，见表1。

2.3 心肌细胞凋亡指数的检测结果 心肌细胞缺血-再灌注后TUNEL染色检测到大量的凋亡细胞(光镜下观心肌细胞核内出现不同程度的黄褐色染色即判断为凋亡细胞)，其凋亡指数显著高于正常对照组(P＜0.01);药物治疗组胞核着色明显减弱，凋亡指数显著低于模型对照组(P＜0.01)(表1)。模型对照组凋亡指数明显高于空白对照组和药物治疗组(P＜0.01)，但药物治疗组凋亡指数高于空白对照组(P＜0.05)。TUNEL标记阳性的细胞核被染成棕褐色，细胞质复染为淡蓝色。

2.4 心肌细胞凋亡率的影响 心肌细胞缺血-再灌注后流式细胞仪记录到典型的凋亡峰，其凋亡率显著高于空白对照组(P＜0.01);药物治疗组凋亡率明显下降，与模型对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)(表1)。

表1 3组大鼠心肌细胞Ca2+浓度、凋亡率和凋亡指数的检测值±s

表1 3组大鼠心肌细胞Ca2+浓度、凋亡率和凋亡指数的检测值±s

与模型对照组比较，*1 P＜0.01;与空白对照组比较，*2 P＜0.05，*3 P ＜0.01

组别Ca2+浓度/(μg·mg-1) 凋亡指数 凋亡率/%药物治疗组 133.72±5.48*1 15.16±1.53*1*2 38.28±1.84*1模型对照组 208.34±6.37 21.32±2.23*3 45.43±4.59*3空白对照组62.55±4.76 3.26±0.68 10.14±1.07

2.5 Western blot检测Rho激酶蛋白表达 Rho激酶蛋白表达通过检测其下游底物PMYPT1水平。Rho激酶蛋白相对表达量以Rho激酶蛋白与β-actin Western blot电泳条带灰度比值表示。空白对照组无Rho激酶激活，模型对照组、药物治疗组均有Rho激酶激活。Rho激酶蛋白相对表达量，设对照组为100%，模型对照组、药物治疗组为正常对照组的倍数。模型对照组PMYPT1水平是空白对照组的6.26倍(P＜0.01)，说明Rho激酶在心肌细胞IRI后有明显的激活。药物治疗组用葛根素干预后，PMYPT1水平较模型对照组降低27.9%，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示药物治疗组对Rho激酶有抑制作用。

3 讨论

凋亡是指细胞由基因控制的主动性死亡过程。RhoA与细胞凋亡有密切关系，PIP3直接激活蛋白激酶B(protein kinase B，PKB，又称 Akt)，而后者通过糖原合成激酶3、果糖磷酸激酶及一个引导潜在的生存信号而调节细胞生存。G蛋白的活性突变成员之一GI3通过依赖于RhoA途径引起细胞死亡。Pur可以使细胞内K+/Na+值升高，抑制细胞内Ca2+的积聚，减少缺血-再灌注时心肌细胞的凋亡，从而心肌细胞生存率增加，具有良好的心肌保护作用［4］。葛根素干预可有效的降低胞内Ca2+浓度，减轻自由基导致的脂质过氧化损伤，达到抗心肌细胞凋亡的作用［5］。

本研究发现，当心肌细胞遭遇缺血-再灌注时胞内明显Ca2+超载，TUNEL染色检测到大量的凋亡细胞，流式细胞仪纪录到典型的凋亡峰，细胞凋亡指数和凋亡百分率显著高于正常对照组，同时透射电镜观察到典型的凋亡超微结构:核固缩、边集、并出现凋亡小体。提示细胞凋亡明确存在于心肌缺血-再灌注损伤的演变过程中，且与胞内Ca2+超载有密切关系。而药物治疗组肌原纤维排列整齐，肌节清晰。线粒体膜基本完整，线粒体排列整齐。核膜完整轻度皱缩，染色质浓缩趋边、呈点状分布。凋亡细胞明显减少。胞内Ca2+浓度比模型对照组显著降低(P＜0.01)，凋亡率、凋亡指数均显著低于模型对照组(P＜0.01)。Pur注射液对心肌缺血-再灌注损伤有保护作用。

RhoA属小分子G蛋白家族，主要通过其下游效应分子Rho激酶ROCK发挥作用。Rho激酶属于丝/苏氨酸蛋白激酶，是Rho的主要效应底物，有两种异构体:ROCK2Ⅰ和 ROCK2Ⅱ［6］。激活状态的 RhoA与ROCK结合，ROCK进一步PMYPT1，从而调节细胞的多种行为，包括细胞形状改变、迁移、基因转录、细胞周期调控等［7］。Rho/Rho激酶通路的主要病理作用是灭活肌球蛋白轻链磷酸酶导致血管痉挛，并可促进炎性因子分泌，参与炎性因子损害过程，促进细胞凋亡;在神经系统，Rho激酶在缺血性神经损伤病理过程中起重要作用，并可抑制神经再生，使神经突触崩解［7］。③Rho激酶抑制药具有神经保护及抗凋亡作用［8-9］。本实验提示模型对照组PMYPT1水平是正常组的6.26倍，说明Rho激酶在心肌细胞缺血-再灌注后有明显的激活。用葛根素干预后，PMYPT1水平较模型对照组降低，提示葛根素对Rho激酶有抑制作用。以上结果说明葛根素可调节缺血-再灌注心肌细胞时Rho激酶的水平，进而提示Rho激酶与缺血-再灌注心肌细胞凋亡的发生密切相关。在本研究中，RHO激酶的活性通过其特异性下游底物MYPT1的磷酸化程度来检测。本研究结果显示，Rho激酶水平较正常组明显上调，说明心肌细胞缺血-再灌注后有明显Rho激酶的激活。用葛根素干预后，缺血-再灌注后Rho激酶水平较缺血-再灌注组明显降低。

综上所述，心肌细胞凋亡明确存在于缺血-再灌注损伤的过程中，Rho激酶导致缺血-再灌注细胞凋亡增加，葛根素可减少缺血-再灌注心肌细胞的凋亡，但其明确机制国内外尚未有研究。本研究表明它对Rho激酶、凋亡基因的调控作用至少部分参与了对再灌注损伤的影响，这为临床治疗相关疾病提供了新的思路。有望成为治疗缺血-再灌注损伤的有效药物。

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