时冬梅，陈复生，赵俊廷，杨宏顺

(河南工业大学粮油食品学院，河南郑州450052)

反胶束体系中酶增溶作用的研究进展

时冬梅，陈复生*，赵俊廷，杨宏顺

(河南工业大学粮油食品学院，河南郑州450052)

论述了含酶反胶束体系的制备方法及影响因素、酶增溶于反胶束的结构模型;对酶增溶于反胶束的国内外研究现状进行了详细的综述，并对其应用前景进行了展望。

反胶束，酶增溶，表面活性剂

反胶束萃取技术分离大豆蛋白和油脂与传统分离技术相比具有明显优势:反胶束萃取过程可实现油脂和蛋白质的同时分离，大大简化了蛋白和油脂分离工艺，减少固定资产投资，降低产品成本;分离过程不需要加入酸或碱，所用表面活性剂和溶剂循环使用，无废水排放，因此解决了环境污染难题，同时无蛋白流失，产品得率高;萃取过程中，蛋白被反胶束内水环境包围，环境接近细胞内的环境，蛋白不易变性，因而保持其生物活性且纯度高;另外，利用酶的“超活性”，萃取过程可以同时进行蛋白质酶法改性，从而为大豆蛋白和油脂的同时分离开辟一条具有良好应用前景的新途径。本文对酶增溶于反胶束的国内外研究现状进行了详细的综述，并对其应用前景进行了展望。

1 反胶束酶体系

1.1 反胶束体系

表面活性剂分子由亲水基(极性头)和疏水基(非极性尾)两部分组成。正常胶束指将表面活性剂溶解在水中，并使其浓度超过临界浓度(Critical Micelle Concentration，CMC)时，表面活性剂在水溶液中聚集到一起而形成聚集体，反胶束是指表面活性剂在超过临界胶束浓度时溶于有机溶剂，在少量水的存在下，为几纳米到几十纳米［1］。此“水池”具有加溶蛋白质和氨基酸等极性物质的能力，形成的纳米尺度聚集体。在这个聚集体的中心有一个小“水池”，一般本文所提及的“加溶”指水(或溶液)进入反胶束极性核中，或指蛋白质溶解于反胶束的“水池”中。反胶束的形状可能为球状、椭球状或圆柱状［2］。

图1 正常胶束与反胶束示意图

当反胶束溶液与蛋白质水溶液或含蛋白质的固相接触后，蛋白质可加溶于反胶束的“水池”中，称为前萃取(或前萃，Forward Extration)(图2)。将含有蛋白质的反胶束溶液与另一水相接触，通过改变条件使蛋白质从反胶束相转移到水相中从而分离出蛋白质，称为后萃取(或后萃，Backward Extration) (图3)。由于周围水层和极性头的保护，蛋白质失活或变性程度很小。

1.2 反胶束酶体系制备和影响因素

反胶束体系具有三种溶解环境:连续有机相、胶束界面和胶束水池。它类似于细胞内环境，使在其中的酶保持原有活性，甚至有时使酶表现出超活性。有机溶剂参与的酶催化反应常用于该体系，酶增溶于反胶束体系方法主要有注入法、液体萃取法和固体萃取法等。

图2 前萃过程

图3 后萃过程

a.注入法:这是将含有酶的缓冲溶液注入到表面活性剂有机溶剂中，然后搅拌至形成透明溶液而形成反胶束酶体系的一种常用方法，该方法可很好地控制反胶束的水含量(w0)。

b.液体萃取法:是将酶从主体水溶液中转移到含有表面活性剂反胶束溶液中而形成反胶束酶体系的另一种方法。通常，该法制得反胶束酶的浓度较高。

c.固体萃取法:它是将反胶束溶液和固体酶直接混合搅拌，使酶进入反胶束体系的一种方法。该法使酶失活严重，一般很少使用。

图4 反胶束酶体系示意图

一般认为，酶在反胶束中的溶解作用，与酶表面电荷同反胶束表面电荷静电作用及反胶束大小有关。所以，任何可增强这种静电作用或导致形成较大反胶束的因素，均有利于酶在反胶束中溶解。实验表明，影响反胶束酶体系形成因素有表面活性剂种类和浓度、体系中水含量、水相酸碱度、水相离子强度和酶分子大小等［3］。

1.3 反胶束酶体系结构及优点

1.3.1 反胶束酶体系结构 目前，脂肪酶和蛋白酶是研究最广的两种酶。关于酶增溶于反胶束中机理有三种不同结构模型(图5):Luisi水壳模型(water shellmode1)［4］、Martinek诱导适合模型(induced fitmode1)［6］、固定尺寸模型(fixed-sizemode1)［5］。

a.水壳模型:Rmp＞Rm，rmp＞rp;b.诱导适合模型:Rmp＞Rm，rmp=rp(rp＞rm);c.固定尺寸模型: Rmp=Rm(rp≤rm)。

Rmp:含酶胶束直径;Rm:未填充胶束直径;rm:未填充胶束水池直径;Rmp:含酶水池直径;rp:酶分子直径［6］。

由图2可知，电压互感器1、2、3、4、5、6、7、8、9和11号A相的量测数据序列之间的平均欧氏距离均小于阈值，而电压互感器10的量测数据序列与上述电压互感的量测数据序列的平均欧氏距离大于阈值，由此可以判定电压互感器10，也就是宾叙一线A相的电压互感器发生故障。

图5 酶增溶于反胶束中的结构模型图

1.3.2 反胶束作为酶增溶反应介质的优点 组成的灵活性;热力学稳定性和光学透明性;反胶束有非常高的界面积/体积比，远高于有机溶剂/水两相体系，使底物和产物的相转移变得极为有利;产物回收可通过相调变实现。反胶束的相特性随温度而变化，这一特性可用于产物回收。

2 反胶束酶体系增溶作用的研究进展

1977年，Martinek［7］等研究了胰凝乳蛋白酶在丁二酸二辛酯磺酸钠(AOT)反胶束体系中的性质，这是关于反胶束酶学的正式研究报道。

到了20世纪90年代，反胶束技术被越来越广地应用在食品行业。CHEN J P［8］用卵磷脂/奶油反胶束系统来酶水解奶油，得到的产品风味良好，且体系为食用级，代表了今后在食品科学上应用的方向，同时也开发出一些价格较低的反胶束体系［9-10］。

由于反胶束用于酶增溶作用介质具有组成灵活、热力学稳定和光学透明，有利于产物和底物相转移及产物回收等很多优点;学者在蛋白质的萃取分离和酶的固定化方面进行了深入研究。Wei Li等人利用反胶束合成α-胰凝乳蛋白酶/聚乙烯吡咯烷酮复合物，即将α-胰凝乳蛋白酶固定化，这样使得其酶活要高于纯酶的活性［11］。Manav B.Bera［12］用反胶束提取淀粉酶，得出表面活性剂AOT的浓度、KCl的浓度对淀粉酶的提取影响显著，而pH对其几乎没影响;得出最佳的工艺条件:pH、AOT的浓度、KCl的浓度依次为10.43、0.05、1.00，提取率可达83.16%。

同时，一些学者介绍利用反胶束体系进行酶的纯化并研究反胶束体系中酶的增溶作用，Konstantza Tonova［13］等介绍利用反胶束体系进行酶的纯化并研究反胶束体系中酶的增溶作用，阐述α-淀粉酶和脂肪酶的纯化与增溶作用。Rashid O.Anarbasev［14］等研究反胶束体系中DNA β-聚合酶在反胶束体系中的活性被提高，从而证明微环境对DNA β-聚合酶的活性有重要的影响。Camille J.Roche［15］等利用反胶束体系研究蛋白的水化特性，证明反胶束体系可以模拟活的细胞环境进行蛋白水化特性等研究。K.E. Nandini，Navin K.Rastogi对CTAB反胶束萃取脂肪酶的各种影响参数进行了研究，得到脂肪酶的活力、提取效率及纯化倍数分别为82.72%、40.27%、4.09［16］。

另外，超活性一直是酶在反胶束体系中研究的主要方面。国内八十年代末期开始有翻译介绍一些反胶束技术的文献。此后，国内开始有反胶束萃取氨基酸、酶、蛋白质的报道。陆强、李宽宏［17］等人以CTAB/正己醇/正辛烷反胶束萃取体系，研究从水溶液中萃取牛血清白蛋白的动力学，测定了多种条件下的表观传质系数，从而判定萃取和反萃取过程各自的控制步骤。

20世纪末期到21世纪初，国内的学者对酶在反胶束中的超活性进行了主要研究，并对其影响因素进行探讨。杨宏顺［18］的研究表明，在反胶束体系中，蛋白酶与反胶束相互作用，表现出“超活性”，并建立了反胶束中酶的动力学模型。以全脂豆粉为原料，在不加酶的情况下蛋白一次萃取率为49.2%，在加入蛋白酶后，蛋白一次萃取率达到60%左右。苑艳辉［19］等对AOT/异辛烷反胶束体系萃取豆豉纤溶酶的前萃工艺进行了研究，酶活回收率62.9%，纯化倍数8.5。许林妹［20］等研究了Gemini型阳离子表面活性剂反胶束体系萃取纤维素酶，萃取率达90%以上，酶活达到121.41%。Yun Zhang［21］等研究发现:木质素过氧化物酶在GGDE/TritonX-100-环己烷-H2O反胶束体系中催化活性比在AOT反胶束体系中高40倍。

近年来，国内学者在蛋白质的萃取分离和酶的固定化方面也进行了深入研究。柳畅先［22］等报道了用反胶束体系固定化醇脱氢酶(ADH)的研究，在此体系中，以十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)作为表面活性剂，辛烷和己醇作为溶剂及助溶剂。考察了ADH固定化的影响因素，确立了最佳固定化条件。姜崇斌等［23］利用碱性蛋白酶在十二烷基磺酸钠(SDS)/异辛烷/正辛醇反胶束体系萃取蛋白的同时对蛋白进行酶解，研究了碱性蛋白酶的加入对萃取的影响，确定了最佳工艺。庹浔［24］等研究十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)-辛烷-己醇反胶束体系对乳酸脱氢酶(LDH)进行固定化，考察了含水量、CTAB和己醇浓度对LDH固定化的影响并得出最佳工艺条件，表明反胶束固定化LDH具有较好的热稳定性。

3 增溶于反胶束中的酶的动力学规律

目前，已报道多种反胶束体系中的酶增溶作用动力学模型。这些模型可归为扩散模型和非扩散模型两类，其差别在于是否考虑扩散(diffusion)问题，也就是底物分子与酶分子分处于不同反胶束微粒中是否会影响或阻碍酶增溶反应的进行。

扩散模型由Verhaert和Oldfield提出，假设酶在反胶束内其动力学本征参数不变，酶在反胶束内行为的变化由底物接近程度的限制(扩散因素)引起。实际上酶在反胶束内获得底物的方式是反胶束的融合，而这种物质交换的速率远快于酶的反应速率。

非扩散模型由Kabanov和Bru提出，认为酶在反胶束内构象的变化导致动力学本征参数的变化。Kabanov假说反胶束存在最佳的大小使酶活力表达最高;Bru假说酶在反胶束体系的不同部位(自由水、束缚水、表面活性剂疏水尾和有机溶剂)时，表现的活力不同。这些假说都缺乏直接的实验证据支持，而且引入参数较多，难以测定，所以迄今为止关于酶在反胶束内动力学规律的理论解释仍有争议。不过实际过程中，使用的底物浓度远小于反胶束浓度，引起局域化浓度效应，这至少是反胶束内酶动力学性质变化的一个原因。

从表面上看，在反胶束体系中的酶增溶作用与在水溶液中没有太大区别，也就是说，反胶束体系不能促进或阻碍反应中间态的形成。但是，在反胶束体系中对酶增溶反应的稳态前动力学研究是很困难的，所以，目前仅采用稳态法来测定Km与kcat值。

如果假定底物主要存在于核心水团中，则底物浓度可有两种表示，即表观浓度 (overallconcentration)与水相浓度(waterpool-concentration)，故Km也有Km，overall与Km，waterpool之分，由于对核心水团的直接研究较为困难，大多数报道的是表观Km。对于水溶性底物来说，由于核心水团的体积很小，底物被浓缩许多倍，Km，overall比水溶液中的Km，bulk有所降低，这似乎是可以预见的现象。但是实际上在许多情况下，Km，overall反而增加，例如对于反胶束体系中的胰蛋白酶，当表面活性剂与底物所带电荷相反时，Km，overall比Km，bulk增大很多。对于反胶束体系中的酶来说，其Km值与酶和反胶束的种类、增溶水量都有关，酶所表现出来的活性更接近于生物体环境。此时决定酶活性大小的是能与酶分子接触的、能维持酶催化反应的底物量，而不是总体系中的底物的多少，此时的Km反映的也不仅是酶分子与底物之间的作用，而且包括微环境对底物的影响。

Nishiki［25］等研究了在AOT/异辛烷反胶束体系溶菌酶和苯丙氨酸通过液-液界面时前萃与后萃的传质特征。

杨宏顺［26］在研究反胶束中中性蛋白酶 AS1· 398反应机理中得到:实验条件下反胶束中中性蛋白酶AS1·398的米氏常数约比水相中米氏常数小1个数量级，模型推导结果与实验结果很接近，说明该模型可用于反胶束中以SPI为底物的AS1·398酶反应。

Yang Liu［27］等人指出，溶菌酶在AOT/异辛烷反胶束体系中的前萃与后萃过程与在边界层内的扩散阻力和在界面上的释放过程密切相关。

María A.Biasutti［28］等人研究酶增溶在表面活性剂中的反应动力学，对其增溶过程的各种影响参数进行分析，并强调了酶增溶于水相和有机溶剂过程中相似点和不同点。同时用目前存在的模型对其结果进行解释。

由于反胶束体系的组成相对于水溶液要复杂得多，必须同时考虑核心水团、表面活性剂分子膜及有机溶剂对酶促反应的影响，因此，提出的模型也较为复杂，关于酶增溶于反胶束中的动力学和机理有待进一步的研究。

4 结语

由于反胶束用于酶增溶作用介质具有组成灵活、热力学稳定和光学透明，有利于产物和底物相转移及产物回收等很多优点;同时，也为亲水性酶、相对疏水酶及疏水性底物或产物提供非常高的界面积/体积比，是一种新的生物催化剂固定化技术，近年来国内外学者在蛋白质的萃取分离和酶的固定化和分离纯化方面进行了深入研究，多倾向于阴离子表面活性剂的应用［29-30］。以往的研究多集中在基础方面，现已开始从基础研究过渡到反胶束中酶增溶作用在药物、食品添加剂、高分子材料的合成和有毒物质的降解等方面的应用研究［31-33］。

科研者对反胶束萃取氨基酸、酶等的影响因素、工艺过程作了相应的研究，取得了较大的进展［34-38］，证明该技术作为分离提纯生物活性物质的一项新技术，不仅具有许多优越性，而且是可行的。但所涉及的大部分是小分子成分［39-40］(如ɑ-淀粉酶、溶菌酶等)，且其研究主要局限在液液萃取方面，而酶在反胶束体系中的增溶作用(液固分离)机理的研究报道尚少。此外，超活性一直是酶在反胶束体系中研究的主要方面。相信随着对胶束酶学基本理论研究的不断深入，通过研究增溶溶解于反胶束中的酶的动力学规律，可以阐明不同反胶束的微环境中酶活力的表达，以及底物和产物分配对酶活力发挥的影响，另外通过探索反胶束体系中酶增溶作用和对蛋白质改性的“超活性”作用机理，可以探讨出蛋白质分子空间结构和分子量大小与反胶束“水池”微观结构(“水池”体积、形状等)相互关系的规律，为探讨反胶束体系中酶增溶作用机理奠定基础，从而实现而且将加快反胶束中酶增溶作用的工业化应用。

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Research advances in enzyme solubilization reaction in reverse micelle

SHI Dong-mei，CHEN Fu-sheng*，ZHAO Jun-ting，YANG Hong-shun
(Henan University of Technology，Zhengzhou 450052，China)

The system of reverse micelles containing enzyme preparation methods and influencing factors，the structure model of enzymes dissolved in reverse micelles was discussed in this paper.And the newest study on development of enzyme solubilization reaction in reverse micelles was introduced and the prospect was given for its application.

reverse micelles;enzyme solubilization;surfactant

TS201.2+5

A

1002-0306(2011)03-0424-05

2010-03-09 *通讯联系人

时冬梅(1985-)，女，研究生，研究方向:食品资源开发与利用。

国家自然基金项目(20976037);国家教育部科学技术重点资助项目(205094);河南省杰出人才创新基金项目(05210005000)。