肖凯夫，郭 晟，庞一林，林元山，*，邹冬生，*

(1.湖南农业大学东方科技学院，湖南长沙410128; 2.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙410128)

产碱性脂肪酶热带假丝酵母LYSC-3的筛选、鉴定及发酵条件的优化

肖凯夫1，2，郭 晟1，2，庞一林1，林元山1，2，*，邹冬生1，2，*

(1.湖南农业大学东方科技学院，湖南长沙410128; 2.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙410128)

以橄榄油为唯一碳源，以溴钾酚紫为显色剂，采用琼脂平板法从富含油脂的土壤中筛选到一株产碱性脂肪酶野生型菌株LYSC-3。经形态学、生理生化和分子生物学的鉴定，确定菌株LYSC-3为热带假丝酵母(Candida tropicalis)。经发酵条件优化，菌株LYSC-3的最佳产碱性脂肪酶的发酵条件为:橄榄油10g·L-1、蛋白胨5g·L-1、蔗糖20g·L-1、(NH4)2SO40.5g·L-1、MgSO4·7H2O 0.2g·L-1，K2HPO40.2g·L-1，pH8.0，35℃，150r·min-1摇床振荡培养3d，获得碱性脂肪酶最高酶活力达38.6U·mL-1。

碱性脂肪酶，发酵条件，假丝酵母，菌株筛选

1 材料与方法

1.1 实验材料

筛选土样 采自浏阳河地区富含油脂的土壤;橄榄油 希腊原产;溴钾酚紫 购于天津市博迪化工有限公司;油脂同化平板培养基、发酵培养基、保藏培养基 均参考文献［4］;其它试剂 均为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 产碱性脂肪酶菌株的筛选、发酵条件优化

1.2.1.1 初筛 在配制好的油脂同化平板培养基中加入0.01%溴甲酚紫，溴甲酚紫为指示剂，溴甲酚紫在pH5.2～6.8，颜色由紫变黄［5］。采用十倍稀释涂布接种法，35℃培养2～4d，根据平板上黄色变色圈直径与产脂肪酶菌株菌落直径的比值，进行菌株活力初筛，按水解圈直径与菌落直径之比挑取菌株，接种斜面;选择比值大的菌株进一步进行摇瓶发酵并测定脂肪酶活力。

1.2.1.2 复筛 将初筛产碱性脂肪酶活力相对较高的菌种接种于100mL/250mL摇瓶发酵培养基中，35℃，200r·min-1摇床振荡培养 72h，将发酵液8000r·min-1离心20min，沉淀用于计算生物量，上清液用于测定酶活力，选择酶活力大的菌株进一步进行发酵条件的优化。

1.2.1.3 发酵条件优化 设计单因素实验，对菌株LYSC-3的培养基碳源(橄榄油)、培养基初始pH、培养温度等单因素进行参数优化。

1.2.2 酶活测定方法 碱滴定测酶活［6］，重复3次，取平均值。

1.2.3 分离菌种的鉴定 参照《常见真菌鉴定手册》［7］进行菌种LYSC-3的生理生化鉴定。

1.2.4 26s RNA的PCR扩增、序列分析和系统发育树的构建［8］以NL1(5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3')和NL4(5'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3'为引物PCR扩增，经北京诺赛基因组研究中心有限公司测序26s RNA序列，LYSC-3菌株的测序结果在NCBI数据库中进行Blastn搜索，获得与其同源性相近的序列，然后用Clustal X1.8软件进行多序列比对，最后利用MEGA 4.0软件构建系统发育树，采用Kimura双参数模型计算各序列分化距离，缺少和不确定的位点在计算中被省略，Boot-strap置信值估算次数1000次。

1.2.5 生物量的测定 采用湿重法测定LYSC-3菌株的生物量，将发酵液以8000r·min-1于高速离心机中离心20min，并用滤纸吸取菌体表面水，称量菌体湿重量，计g·L-1。

2 结果与分析

2.1 产碱性脂肪酶菌株的筛选

从富含油脂的土样中采集样品，按水解变色圈直径与菌落直径的比值大小挑选菌株，得到比值大于4.0的脂肪酶菌株21株，比值大于6.5的脂肪酶菌株7株，经反复初筛，摇瓶复筛后，获得1株酶活力相对较高的菌株，标注为LYSC-3菌株，该菌株水解变色圈直径与菌落直径的比值为9.6，该菌株的溴钾酚紫显色平板见图1。

由于微生物产脂肪酶可降解培养基中底物橄榄油产生脂肪酸和甘油，脂肪酸使中性的油脂同化平板培养基pH降低，培养基部分局域颜色由紫变黄，因此，平板上黄色变色圈直径与产脂肪酶菌株菌落直径的比值初步反映了脂肪酶活力大小。由图1可以看出，所获菌株产脂肪酶活力高且酶活稳定。

图1 菌株Candida tropicalis LYSC-3在筛选培养基上的菌落形态

2.2 菌株的鉴定

2.2.1 菌株的生理生化特性 菌株 LYSC-3在麦芽汁琼脂上菌落为奶油色，稍有光泽，软而平滑。培养4d后，可看到假菌丝。在显微镜下呈现球状或卵状形，见图2。菌株LYSC-3兼性厌氧发酵葡糖;接触酶实验为阳性;葡萄糖、山梨醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、甘露醇、木糖和阿拉伯糖为阳性，鼠李糖为阴性，从形态学初步确定为酵母属。

图2 Candida tropicalis LYSC-3光学显微照片(放大1000倍)注:A-未染色;B-结晶紫染色。

2.2.2 遗传学特征 为了进一步确定菌株 LYSC-3的分类学地位，通过PCR扩增26s RNA得到603bp的DNA片段，将片段回收纯化后测序，测序结果提交GenBank，获得登录号GU388393，使用生物软件构建进化树，见图3。LYSC-3菌株与Candida属内各菌株的同源性在95.90%～99.90%之间，系统发育分析归于同一分枝，结合形态学和生理生化特征，确定其为Candida tropicalis属，命名为 Candida tropicalis LYSC-3菌株。

图3 Candida tropicalis LYS-3菌株及相关菌株的系统发育树

2.3 LYSC-3菌株的产酶条件的优化

为确定LYSC-3菌株的产酶条件，设计单因素实验梯度，对发酵温度、培养基起始pH、橄榄油含量进行发酵条件初步优化，将测定的酶活力用excel作图，结果见图4～图6。

图4 发酵温度对菌株Candida tropicalis LYSC-3产脂肪酶的影响

发酵温度对菌株Candida tropicalis LYSC-3产脂肪酶的影响见图4，从图4可知，Candida tropicalis LYSC-3在30～37℃之间生长良好，菌体湿重在16～17g·L-1之间。35℃时，该菌的脂肪酶活力达最大，达35.2U·mL-1，其次为37℃和32℃，分别为33.7U·mL-1和30.8U·mL-1，经t检验，这三个温度的脂肪酶活力与低温区和高温区比较，均具显著性差异(p＜0.05)。

从图5可知，在35℃条件下，Candida tropicalis LYSC-3在发酵培养基的起始pH5～7之间生长良好，菌体湿重在15～16g·L-1之间。发酵培养基起始pH为8时，该菌的脂肪酶活力达最大，达36.4U·mL-1;然后随着pH的增加，该菌的脂肪酶酶活力和生物量均显著降低，经t检验，该菌株的脂肪酶活力与其低pH区和高pH区比较，均具显著性差异(p＜0.05)，可见，培养基起始pH影响脂肪酶活力和生物量的大小。

图5 培养基起始pH对菌株Candida tropicalis LYSC-3产脂肪酶的影响

在35℃，pH8的条件下，在发酵培养基(每1000mL)中橄榄油含量对Candida tropicalis LYSC-3产脂肪酶活力影响见图6，从图6可知，榄油含量从0增加至10mL，脂肪酶活力增加较快。橄榄油含量为10mL时，接近最大，达38.6U·mL-1，与橄榄油含量3～6mL比较，具显著性差异(p＜0.05)，然后随着橄榄油含量的增加，脂肪酶活力基本趋于稳定。但橄榄油含量对Candida tropicalis LYSC-3生物量的贡献不明显，而对脂肪酶产率影响很大，说明橄榄油含量对Candida tropicalis LYSC-3产脂肪酶具有明显的诱导作用，也是影响脂肪酶分泌的关键因素之一。

3 讨论

图6 橄榄油对菌株Candida tropicalis LYSC-3产脂肪酶的影响

目前，通过诱变等手段，获得脂肪酶产生菌的报道甚多，但酶活力大多在70U·mL-1以下，如曾璐等［9］以三羧酸甘油脂为底物，筛选一株产脂肪酶杆菌，酶活力为68.58U·mL-1;张振乾等［10］从含油土样中筛选到一株产碱性脂肪酶的产气肠杆菌，酶活力为66.31U·mL-1;周军［11］以橄榄油为底物，从富含油脂的土壤中分离筛选到产脂肪酶R-1野生型菌株，酶活力为27.70U·mL-1。本实验从富含油脂的土壤中筛选到一株产碱性脂肪酶菌株Candida tropicalis LYSC-3，未经任何诱变，在初步优化的发酵条件下，碱性脂肪酶活力就达38.6U·mL-1，可见该菌株具有较大的开发潜力。经形态学和分子生物学鉴定为热带假丝酵母Candida tropicalis LYSC-3，关于热带假丝酵母产碱性脂肪酶的报道甚少。该菌株可以进一步通过诱变筛选提高酶活，甚至采用基因工程技术对该酶基因进行克隆，有望进一步发掘其潜能。

总之，野生型Candida tropicalis LYSC-3的最佳产碱性脂肪酶发酵条件为:橄榄油10g·L-1、蛋白胨5g·L-1、蔗糖 20g·L-1、(NH4)2SO40.5g·L-1、MgSO4·7H2O 0.2g·L-1、K2HPO40.2g·L-1，pH8.0，35℃，150r·min-1摇床振荡培养3d，获得碱性脂肪酶最高酶活力达38.6U·mL-1。

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［5］张玲.微生物学实验指导［M］.北京:北京交通大学出版社，2007:215.

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［9］曾璐，林亲录，王伟.脂肪酶产生菌产酶条件的研究［J］.现代食品科技，2007，23(7):15-21.

［10］张振乾，官春云.可催化生产生物柴油脂肪酶产生菌的筛选及其培养条件研究［J］.中国油脂，2009，34(1):41-42.

［11］周军.产脂肪酶菌株的筛选及脂肪酶发酵条件的研究［J］.河北农业科学，2008，12(2):1.

Screening，identification of Candida tropicalis LYSC-3 excreting lipase and optimization of fermenting conditions

XIAO Kai-fu1，2，GUO Sheng1，2，PANG Yi-lin1，LIN Yuan-shan1，2，*，ZOU Dong-sheng1，2，*
(1.Orient Science＆Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China; 2.College of Bioscience＆Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China)

A strain of LYSC-3 was screened by bromocresol purple media agar plate from oil rich soil.LYSC-3 was identified as Candida tropicalis by methods of morphology，physiology and molecular biology.Fermentation conditions were also optimized through single factor.Results indicated that lipase activity reached 38.6U·mL-1when Candida tropicalis LYSC-3 was cultured on the media of olive oil 10g·L-1，peptone 5g·L-1，sugar 20g·L-1，(NH4)2SO40.5g·L-1，MgSO4·7H2O 0.2g·L-1，K2HPO40.2g·L-1，pH8.0，rotated at 150r·min-1at 35℃for 3d.

alkaline lipase;fermentation condition;Candida tropicalis;screening

TS201.3

A

1002-0306(2011)03-0218-03

脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3，甘油酯水解酶)是一种重要工业酶类，能催化天然底物油脂生成甘油和游离脂肪酸，广泛应用于食品、制革、饲料、洗涤、油酯化工等传统工业领域［1］。脂肪酶的来源主要有:植物种子、微生物和动物组织［2］。微生物脂肪酶种类最多，广泛存在于细菌、酵母和霉菌中，最易获得并用于大规模生产，且具有比动植物脂肪酶更广的pH、温度适应性，因此是工业用脂肪酶的重要来源［3］。近20年来，微生物脂肪酶发酵研究主要集中在高产菌株的筛选。本实验旨在通过溴钾酚紫平板显色法和碱滴定测脂肪酶活法相组合的筛选方案，获得脂肪酶高产野生菌株，并对其发酵条件进行了优化。

2010-03-17 *通讯联系人

肖凯夫(1986-)，男，硕士研究生，研究方向:生物化学与分子生物学。

湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目(DFXYKCSJ003)。