何勇琴，潘迎捷，卢 瑛

(上海海洋大学食品学院，上海201306)

食品中单核细胞增生性李斯特菌的快速分离鉴定

何勇琴，潘迎捷，卢 瑛*

(上海海洋大学食品学院，上海201306)

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，简称单增李斯特菌)是一种重要的食源性致病菌，能引起人畜共患李斯杆菌病。本文采用两种不同的增菌分离方法从散装牛奶和猪肉中共分离得到8株单增李斯特菌。通过革兰氏染色、生化鉴定、PCR扩增hlyA基因、16S rDNA测序、血清分型等一系列实验对可疑菌株进行分析鉴定。综合实验结果和其他单增李斯特菌分离标准，探讨开发了一种快速分离鉴定单增李斯特菌的方法，该方法可在4～5d内完成单增李斯特菌的分离检测过程。

单增李斯特菌，快速，分离，鉴定，hlyA基因，血清分型

1 材料与方法

1.1 实验材料

样品1 猪肉，购于上海黄浦区徽宁路菜市场菜市场;样品2 散装牛奶，购于上海郊区;胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤(TSB-YE)、胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂(TSA-YE)、BLEB基础及相应添加剂、Fraser肉汤基础及添加剂、牛津琼脂(OXA)基础(Oxford Agar Base)及相应添加剂、PALCAM培养基基础及相应添加剂 根据产品说明进行配制;单增李斯特菌生化鉴定套装 以上产品均购自北京陆桥技术有限责任有限公司;BioFlux DNA提取试剂盒 购自杭州博日科技有限公司;李斯特菌抗血清试剂 购自日本Denka Seiken公司。

1.2 实验方法

实验采用了2种方法从样品中分离单增李斯特菌。其中样品1参照FDA的分离方法，采用了BLEB增菌液和OXA选择性培养基，样品2参照ISO的分离方法，采用了Fraser肉汤增菌液和PALCAM选择性培养基，此两种方法的区别在于前增菌和分离方法的不同，鉴定方法完全一致。

1.2.1 预增菌处理 称取25g样品1，放入均质袋，加入225mL无菌生理盐水，均质拍打2min。取25mL样品2加入225mL无菌生理盐水，混匀。取样品1的均质液25mL，无菌条件下加入到225mL的BLEB增菌液中，30℃摇床培养4h，加入选择性试剂吖啶黄、萘啶酮酸和放线菌酮，30℃摇床培养48h。

取样品2的均质液25mL，无菌条件下加入到225mL的Half Fraser肉汤中，30℃摇床培养24h，取1mL培养液，加入到10mL Fraser肉汤中，继续培养至48h。

1.2.2 分离纯化 取样品1的48h增菌液划线接种于OXA琼脂平板，36±1℃培养48h。

样品2的二次增菌液若变黑，梯度稀释增菌液，选取合适的梯度稀释液0.1mL涂布于PALCAM琼脂平板，36±1℃培养48h。

挑取上述两种平板的可疑菌落划线接种于TSA-YE琼脂平板。

1.2.3 革兰氏染色和生化鉴定 挑取TSA-YE琼脂平板上已纯化单菌落进行革兰氏染色和生化鉴定，生化鉴定包括TSI三糖铁实验、硝酸盐肉汤、MRVP、尿素酶、糖发酵实验(七叶苷、木糖、葡萄糖、麦芽糖、鼠李糖、甘露醇)。

1.2.4 PCR扩增hlyA基因 将TSA-YE琼脂平板上菌落接种于TSB-YE，30℃摇床培养15h。按照试剂盒提取可疑菌落的DNA。针对单增李斯特菌的溶血毒素基因hlyA，参考文献［6］合成hlyA基因引物。上游:5'-ACGCAGTAAATACATTAGTG-3'，下游: 5'-AATAAACTTGACGGCCATAC-3'。上、下游引物由上海生物工程有限公司合成，拟扩增片段大小为372bp。PCR反应体系:DNA模板1.0μL、25μmol/L上下游引物各1.0μL、2.5mmol/L脱氧核糖核苷酸(dNTPs)1.0μL、5U/μL Taq酶0.2μL、10倍缓冲液2.0μL(含 Mg2+)、去离子水13.8μL，总体积20μL。PCR反应程序:94℃预变性5min;94℃ 30s，58℃30s，72℃ 1min，30个循环;72℃延伸7min，10℃保存。反应结束后，经1.0%琼脂糖凝胶电泳30min，在凝胶成像系统中读取扩增结果。

1.2.5 16S rDNA测序 以1.2.4中提取的DNA为模板，采用16S rDNA的通用引物进行PCR扩增，产物交由上海桑尼生物科技有限公司测序。

1.2.6 血清型鉴定 可疑菌落的血清型鉴定参照李斯特菌抗血清试剂说明书。O抗原采用玻片凝集的方法，H抗原采用试管凝集的方法。

2 结果与分析

2.1 增菌结果

样品1在BLEB增菌液中培养48h后，除明显浑浊外无其他现象。样品2在Half Fraser肉汤中增菌24h，增菌液变黑。这主要是因为Half Fraser肉汤中含有七叶苷，所有的李斯特菌都可以水解七叶苷，水解产物和添加剂中的柠檬酸铁铵产生颜色反应，使菌液变黑，以此可初步判断李斯特菌的存在，具体结果见表1。若24h菌液未变黑，继续培养24h，仍未出现黑色现象，可视为无李斯特菌的存在。

2.2 分离纯化

样品1划线于OXA琼脂平板培养48h后，平板上出现直径约1mm的黑色菌落。此时可初步判断李斯特菌的存在。样品2经48h增菌后基本可以断定有李斯特菌的存在，涂布于PALCAM平板上，平板上出现小的灰绿色菌落，外围有水解环，进一步证明李斯特菌的存在。

2.3 革兰氏染色和生化鉴定结果

OXA和PALCAM平板上共挑选出8个可疑菌落。TSA-YE平板上可疑菌落镜检结果均为革兰氏阳性。8个可疑菌落生化鉴定结果完全一致，且和标准菌株的生化反应现象也完全一样(见表1)。TSI三糖铁斜面和底部均变黄，发酵葡萄糖、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷，不发酵木糖、甘露醇，MR-VP阳性，硝酸盐肉汤和尿素酶均为阴性。

2.4 PCR扩增结果

8株实验室分离的单增李斯特菌PCR检测全部呈阳性，在400bp附近出现目的条带，和预期片段大小(372bp)相吻合，而其它两株同属异种菌未出现目的条带，其中阴性对照2尽管出现3条非特异性条带，但和目的条带相差甚远，对实验结果的判断干扰甚微。电泳结果见图1。

图1 单增李斯特分离株PCR结果注:M:DL-100标样;1:空白;2、3:阴性对照，为英诺克李斯特菌食品分离株; 4:单增李斯特菌标准菌株ATCC7644; 5～12:Listeria monocytogenes分离株。

2.5 DNA测序结果

16S rDNA测序结果显示，8株可疑菌株均为单增李斯特菌。

表1 革兰氏染色和生化鉴定结果

表2 不同预增菌和分离纯化方法的比较

2.6 血清型鉴定结果

综合O抗原和H抗原的反应结果，8株可疑菌落的血清型均为1/2a。

3 讨论

通过单增李斯特菌两种不同分离纯化方法的比较可知，采用Fraser肉汤增菌液可以在较短的时间(24～48h)内断定李斯特菌的存在与否，这也是采用Fraser肉汤增菌液的优点所在。在24h和48h的关键点处，可以判断样品中单增李斯特菌的存在情况并对后续实验进行相应安排，节约分离时间和成本。推荐采用Fraser肉汤增菌液，尽管可能会出现漏检的情况，但由于实验的目的是大量分离单增李斯特菌，所以可以忽略漏检的因素。OXA或PALCAM平板培养基，在实际的分离工作中，二者的分离效果未见明显差异，均可准确分离增菌液中的李斯特菌，因此，在实际的工作中，二者任选其一即可。

本研究在单增李斯特菌的鉴定方面采用了传统和快速鉴定相结合的方法，一方面保证了结果的正确性;另一方面快速鉴定方法的可行性和真实性可以通过传统方法得到验证。鉴于经济节约的大量分菌目的，在实际大量样本的分菌工作中，革兰氏染色和生化鉴定可以略去，因为 Fraser肉汤增菌液和PALCAM(或OXA)选择性培养基的双重筛选作用，基本上保障了90%以上的准确性。就PCR扩增而言，hlyA基因是单增李斯特菌所特有的毒力标志基因［7-9］，从理论上保证了PCR扩增检测单增李斯特菌的正确性。实际的扩增过程也充分证实了PCR鉴定的准确性，因此PCR扩增hlyA基因完全可以作为单增李斯特菌的鉴定指标之一。

本实验的不足之处在于DNA提取方面，采用了试剂盒提取的方式。试剂盒的方法一定程度上保证了DNA的得率，但用时较长需3h，且费用相对较高，因此建议在大规模分菌时采用其他更为快速简便的DNA提取方法，以进一步节约时间和费用。

综上所述，采用Fraser肉汤增菌液结合PALCAM (或OXA)选择性培养基与PCR扩增(或16S rDNA测序)三大步骤就可以从环境或食品样本中快速分离鉴定出单增李斯特菌。在单增李斯特菌的分离鉴定方面，行标SN/T0184.1-2005需要5～6d，国标GB/T 4789.30-2008则需要11～16d的时间，而采用本文的三大分离步骤，可以在4～5d内完成单增李斯特菌分离鉴定的整个过程，且可在48h内基本确定食品中是否存在李斯特菌，根据该判定结果进行实验设计和优化，可大大简化分离鉴定步骤，降低成本。因此，我们认为本文的方法不仅适合于大量样本中单增李斯特菌的分离鉴定工作，且适用于一般实验室的单增李斯特菌分离纯化工作。

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Rapid isolation and identification of Listeria monocytogenes in foods

HE Yong-qin，PAN Ying-jie，LU Ying*
(College of Food Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China)

Listeria monocytogenes is an important food-borne pathogenic which can cause listeriosis both in human and animals.8 Listeria monocytogenes were isolated from bulk milk and pork using two different enrichmentisolation methods.A series of experiments(Gram stain，biochemical identification，PCR amplification of hlyA gene，16S rDNA sequencing and serotyping)were employed to analyze and identify the suspicious colonies.A rapid method to isolate and identify Listeria monocytogenes was developed on the basic of the experimental results and the other separation standards.The detection process can be completed within 4～5d using the above method.

Listeria monocytogenes;rapid;isolation;identification;hlyA gene;serotyping

TS201.1

A

1002-0306(2011)03-0215-04

单核细胞增生性李斯特菌(简称单增李斯特菌)是一种重要的食源性致病菌，能在冷藏温度下繁殖，因其细胞的苯酚水浸出物可以诱导单核细胞的生成，从而获得了“单核细胞增生细菌”这个种名［1］。该菌分布广泛，对不利因素如低温、高渗、抗菌物质有抵抗作用，还能在物体表面形成生物膜［2-3］。据报道，4%～8%的水产品，5%～10%的奶及其产品，30%以上的肉制品及15%以上的家禽可被该菌污染。美国、加拿大等国曾多次爆发由该菌引起的食物中毒事件，死亡率达30%以上［4］。由于单增李斯特菌引起的感染病死率高，危害大，引起了国际上的高度重视。WHO将其列为20世纪90年代四大食源性致病菌之一［5］，并在2000年建立了全球监测网，在世界范围内开展与食源性致病菌相关疾病的监测。1994年我国颁布了食品中单增李斯特菌的标准检验方法，并于2003年、2008年分别做了进一步的修改，但目前我国对单增李斯特菌的广泛种群特征及其生态分布方面的调查尚未见到报道。鉴于这种现状，广泛采集各种环境和食品样品，分离鉴定其中的单增李斯特菌，并探讨该菌在环境以及食品中的分布状况，研究该菌的污染状况以及分布特征可以为预防李斯特菌病的爆发、流行及追踪污染源提供理论依据。本文在2008年最新修改单增李斯特菌国标的基础上，结合FDA(Food and Drug Administration)和ISO (International Organization for Standardization)的检测方法，比较研究了两种预增菌和分离纯化的方法，采用传统和快速鉴定相结合的方式验证可疑菌株，旨在探讨开发一种更为经济效率高的适于大量样本的单增李斯特菌分离鉴定方法。

2010-03-10 *通讯联系人

何勇琴(1985-)，女，硕士研究生，研究方向:食品科学与工程。

上海海洋大学博士启动基金(B-8203-08-0220);上海市教委创新项目(09YZ274);国家科技支撑计划项目(2008BAD94B09)。