王 硕，何 欢，王俊平，姚玉超，宋国欣

(天津科技大学食品营养与安全教育部重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457)

基于分子印迹材料的雌酮快速检测方法研究

王 硕，何 欢，王俊平，姚玉超，宋国欣

(天津科技大学食品营养与安全教育部重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457)

以合成的雌酮分子印迹聚合物为微柱填料，建立了分子印迹聚合物富集雌酮原位显色反应的方法，并对影响测定结果的显色剂用量、填料量、上样流速和上样时间等主要实验参数进行了优化，在印迹材料填料量为0.030g，上样流速为1.0mL·min-1，1.00μg·L-1雌酮-甲醇标准溶液富集10.0mL条件下，再加入稀氢氧化钾-乙醇溶液1.0mL条件下，显色剂15.00g·L-1间二硝基苯溶液1.0mL，在暗处反应1h，最低检出限可达10.00μg·L-1。为了验证所建立的方法的实用性，本研究对湖水样品中的痕量雌酮残留进行了检测分析。通过对检测为空白的样品进行浓度为10.00，50.00，100.00μg·L-1的添加，以所建立的分析方法进行检测，结果均有比较明显的颜色反应，从而说明所建立的检测方法的可行性。

雌酮，分子印迹聚合物，显色反应

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

雌酮 Fluka公司，分析纯;丙烯酰胺 Sigma公司，分析纯;二甲基丙烯酸乙二醇酯 Organics公司，分析纯;偶氮二异丁腈 天津市科密欧化学试剂开发中心，分析纯;间二硝基苯 北京通县育才精细化工厂，分析纯。

紫外-可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;RH-KT/C加热磁力搅拌器 广州仪科技术有限公司;SH-III型循环水式真空泵 浙江黄岩求精真空泵厂;真空干燥箱 天津市三水科学仪器有限公司; Centrifuge 5804R台式冷冻离心机 德国 Eppendorf公司。

1.2 实验方法

1.2.1 雌酮分子印迹聚合物MISPE柱的制备 雌酮分子印迹聚合物的制备方法参考Zhixiang Xu等的文献方法［4］。将所合成的雌酮分子印迹材料装在一个空的MISPE柱中，分别用5.0mL甲醇和5.0mL双蒸水润洗MISPE柱后备用。

1.2.2 分子印迹聚合物快速富集雌酮原位显色方法将MISPE柱中的富集了雌酮的分子印迹材料完全抽干，然后加入1.0mL乙醇溶液，使吸附了雌酮后的分子印迹材料完全浸泡于乙醇中，然后加入1.0mL稀氢氧化钾-乙醇溶液，使其完全反应，最后加入15g·L-1纯化好的间二硝基苯溶液，在暗处放置1h后，观察其颜色反应。

图1 分子印迹聚合物快速富集雌酮方法

2 结果与讨论

2.1 分子印迹聚合物富集雌酮原位显色反应方法优化

2.1.1 分子印迹聚合物填料量的优化 印迹材料填料量优化实验中，上样浓度为10.00μg·L-1，雌酮标准溶液10.0mL，上样时间控制在10min，即上样流速为1.0mL·min-1。显色剂用量为15.00g·L-1间二硝基苯溶液1.0mL。印迹材料填料量分别为0.030、0.050、0.080g。

从图2可以看出，填料量为0.030g时，颜色已经很明显，说明印迹材料已经对雌酮标准溶液得到了较好的吸附，而填料量为0.050，0.080g时，可以明显看出有很多印迹材料还没有颜色，这样就会造成印迹材料的浪费。

图2 填料量的优化

由于实验中要求快速检测，本实验选取了不同浓度的雌酮标准溶液在1mL·min-1的条件下富集10mL，即在短短10min完成吸附，所以根据经验，以及吸附动力学实验，可以分析出，在最初的10min，本实验采用的本体聚合合成的分子印迹材料，可以吸附饱和吸附容量的5%，即30mg最多可吸附3mg·L-1。由于本体聚合方法的传质速度的影响，如果填料量过少，在10min不能达到理想的吸附效果;环境中的雌激素一般都痕量存在，因此填料量过多，不但会造成印迹材料的浪费，还会影响上样时间，使检测时间延长，减低时效性，所以最终选择填料量为0.030g。

2.1.2 显色剂间二硝基苯用量的优化 显色剂用量优化实验中，印迹材料的填料量为0.030g，上样浓度为100.00μg·L-1雌酮标准溶液10.0mL，上样时间控制在10min，即上样流速为1.0mL·min-1。显色剂用量分别为 5.00、10.00、15.00g·L-1间二硝基苯溶液各1.0mL。

从图3可以看出，5.00g·L-1间二硝基苯溶液1.0mL基本上没有颜色，而10.00g·L-1间二硝基苯溶液1.0mL用肉眼可以观察到很浅的颜色，而15.00g·L-1间二硝基苯溶液1.0mL可以明显观察出颜色，最终选择显色剂用量为 15.00g·L-1间二硝基苯溶液1.0mL。

图3 显色剂用量的优化

2.1.3 上样流速和时间的优化 上样流速和时间的优化实验中，印迹材料的填料量为0.030g，上样浓度为10.00μg·L-1雌酮标准溶液10.0mL，显色剂用量为15.00g·L-1间二硝基苯溶液1.0mL。上样时间分别为1(采用注射器直接注射雌酮标准溶液)、10、20min，即上样流速分别为10.0、1.0、0.5mL·min-1。

从图4可以看出，当采用注射器直接注射时，颜色基本上没有变化，而采用10.00μg·L-1雌酮标准溶液10min富集10.0mL，即1.0mL·min-1时，从颜色上与采用 10.00μg·L-1雌酮标准溶液 20min富集10.0mL，即0.5mL·min-1的对比，可以判断，基本上已经达到完全吸附，最终选择10.00μg·L-1雌酮标准溶液10min富集10.0mL，即流速1.0mL·min-1为最佳上样时间和流速。

图4 上样流速和时间的优化注:上样流速从左到右依次为10.0、1.0、0.5mL·min-1。

2.2 分子印迹材料与非印迹材料的比较

从图5看出，当左边的MISPE柱填入0.030g分子印迹聚合物，右边的MISPE柱填入0.030g非印迹聚合物，分别用5.0mL甲醇和双蒸水来润洗MISPE柱，然后分别添加50.00μg·L-1雌酮标准溶液10.0mL，上样时间控制在10min，上样流速为1.0mL·min-1，加入稀氢氧化钾-乙醇溶液 1.0mL，最后加入浓度为15.00g·L-1显色剂间二硝基苯溶液1.0mL，在暗处反应1h后，可以明显看到，印迹聚合物材料呈现出紫红色，说明印迹材料与非印迹材料相比有明显的显色反应。

图5 分子印迹材料与非印迹材料的比较注:雌酮浓度均50.00μg·L-1。

2.3 实际样品的测定结果

为了评价所建立方法的实际应用价值，以天津科技大学校园内的湖水为样品(经液相检测未检测到含有雌酮)固相萃取与Zimmermann反应来检测实际样品中的雌酮的研究，采用三个浓度(10.00、50.00、100.00μg·L-1)添加，并分别进行了显色反应，见图6。结果表明:三种浓度下样品具有比较明显的显色反应。

湖水经过0.2μm水系膜过滤后，放入瓶中备用。

将10.00mg·L-1雌酮标准溶液5、25、50μL添加到湖水样品中，分别定容至50mL容量瓶中，混匀，4℃保存。

分别将MISPE小柱中装入0.030g分子印迹材料，分别用5.0mL甲醇和5.0mL双蒸水润洗，然后将三个浓度添加到小柱中，每种浓度富集10.0mL，然后进行显色反应。

从图6中可以看到，浓度从左到右为10.00、50.00、100.00μg·L-1的MISPE小柱的颜色是逐渐加深的。由于湖水有些发黄，所以导致颜色要比较深。

由图6可知，所建立的方法对湖水中添加的雌酮具有比较高的灵敏度、准确性和实用性。湖水样品除滤膜过滤外未进行其他前处理，表明这种方法用于测定环境中的实际样品时，几乎没有基质的影响作用，可以省去传统方法需要去除复杂样品基质的影响过程。

图6 湖水样品检测浓度注:雌酮浓度从左到右为10.00、50.00、100.00μg·L-1。

3 结论

本实验采用本体聚合法合成的印迹材料，具有操作条件易于控制，实验装置简单，便于普及等特点，所以是理想的合成吸附材料，将其作为固相萃取材料，通过Zimmermann反应，对雌酮的检测进行了定性分析。本研究成功建立了具有高选择性和高灵敏度检测雌酮的方法，可用于水中雌酮的快速测定，为测定环境中雌激素污染物提供了一条有效途径。

［1］D’Ascenzog，Di Corcia A，Gentili A，et al.Fate of natural estrogen conjugates in municipal sewage transport and treatment facilities［J］.Science of The Total Environment，2003，302 (1-3):199.

［2］Lewis R J.Carcinogenically Active Chemicals［M］.NewYork: Van Nostrand Reinhold Company，1990:133.

［3］Zimmermann W.Method of determination of 17-ketosteroids［J］.Z Vitamhorm Fermentforsh，1951，4(5):456-466.

［4］Wang S，Xu ZX，FanggZ，et al.Separation and Determination of Estrone in Environmental and Drinking Water by Molecularly Imprinted Cartridge Coupled withhPLC［J］.Journal of Separation Science，2008，31(6-7):1181-1188.

Rapid determination estrone method on the basis of molecular imprinted polymer

WANG Shuo，HE Huan，WANG Jun-ping，YAO Yu-chao，SONG Guo-xin
(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety Ministry of Education，Tianjin University of Science＆Technology，Tianjin 300457，China)

A method to detect trace estrone in environment was developed with a novel molecularly imprinted polymer as enrichment sorbent for situ enrichment of estrone by color reaction.The parameters affecting the procedure including the color reagent，the weight of MIPs，loading flow rate and time were optimized.With a loading flow rate of 1.0mL·min-1for sampling 10.0mL of 1.00μg·L-1estrone-methanol solution，then add in watery KOH-ethanol solution 1.0mL and color reagent 1.0mL of m-Dinitrobenzene 15.00g·L-1reacted 1h in dark.The detection limit was 10.00μg·L-1.To evaluate the usefulness of the novel imprinted sorbent，the samples of lake water from Tianjin University of Science＆Technology，determined to be free of estrone，were spiked with three levels of estrone(10.00，50.00 and 100.00μg·L-1)and analyzed after simple pretreatment under optimal experimental conditions.At each concentration，evident change of color in lake water，respectively.It is proved that the detection of estrone in environment is feasible in this method.

estrone;molecularly imprinted polymer;color reaction

TS207.3

A

1002-0306(2011)03-0393-03

雌酮是人体及动物自身分泌的一种雌性激素，近年来由于环境污染的加剧，雌酮在环境中、食品中残留问题受到广泛关注。雌酮已经被证实在很低的浓度下就会干扰人体的内分泌系统，危害人体的生殖功能，阻碍卵细胞生长，抑制精子产生，因此，建立环境和食品中雌酮的检测方法特别是快速检测方法对于加强雌酮残留的监控具有重要意义［1-2］。目前，检测环境中的雌酮常用方法主要有仪器分析法和免疫分析法。仪器分析法虽然灵敏度高，操作简单，但费用比较昂贵。而免疫分析法虽然灵敏度高，快速简便，费用低，但天然抗体存在制备复杂、对检测环境的温度和pH等多种条件要求严格，应用受到限制。分子印迹技术是当前发展高选择性材料主要的方法之一，分子印迹聚合物可以选择性吸附模板分子，目前已经被广泛地应用于各种难以分离化合物的选择性分离、富集，是目前国际研究的热点。本实验采用分子印迹技术的本体聚合法制备了对雌酮具有特异性吸附的分子印迹聚合物，并应用Zimmermann显色反应［3］建立了环境中的雌酮的快速检测方法。

2010-01-26

王硕(1969-)，男，博士，教授，研究方向:食品安全检测。

国家自然科学基金项目(30571532)。