李 玲，曾庆坤，唐 艳

(中国农业科学院广西水牛研究所，广西南宁530001)

双抗体夹心酶联免疫法测定水牛初乳中的IGG

李 玲，曾庆坤*，唐 艳

(中国农业科学院广西水牛研究所，广西南宁530001)

为快速、准确地测定水牛初乳中IgG活性质量浓度，建立了双抗体夹心酶联免疫分析法(ELISA)。结果表明，IgG活性质量浓度的对数值与吸光值存在很好的线性关系，其标准曲线方程式为γ=-0.2907x2+2.0819x+0.8689，相关系数R2=0.9937，线性范围在7.8～1000ng/mL，平均回收率在84.40%～96.71%之间，灵敏度高、重现性好，可用于水牛初乳及其制品中IgG活性质量浓度的检测。

酶联免疫法，水牛初乳，IgG

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

亲和纯化牛IgG抗体、标准牛IgG、牛IgG-HRP (酶标二抗)等 均购自美国Fitzgerald公司;可溶型单组分TMB(四甲基联苯胺)底物溶液 购自天根生化科技(北京)公司;Tris碱 Sigma公司生产; Na2CO3、NaHCO3、NaCl、Tween-20、H2SO4均为分析纯。

酶联免疫检测仪 芬兰Labsystems NK3型;离心机 长沙湘仪L550型;八道可调式移液器，塑料离心管，96孔酶标板，微型振荡器，电子天平，精密pH计。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的配备 包被缓冲液:0.05mol/L Na2CO3及0.05mol/L NaHCO3，按照v/v=3∶7混匀后，用二者调pH至9.6，4℃冰箱中保存备用。

清洗液:0.05mol/L Tris-HCl 800mL，用盐酸调pH至8.0，加NaCl 8.1816g以及0.5mL Tween-20混匀，定容至1000mL，4℃冰箱中保存备用。

表1 ELISA法测定牛IgG的精密度

表3 麽拉水牛初乳中IgG质量浓度的变化

样品/标准样品稀释液:0.05mol/L Tris，0.14mol/L NaCl，0.05%Tween-20，pH 8.0，4℃冰箱中保存备用。

封闭液:0.05mol/L Tris，0.14mol/L NaCl，0.05% Tween-20，pH 8.0，4℃冰箱中保存备用。

底物液:TMB-H2O2溶液，即用型，使用前若呈蓝色则不可用，4℃冰箱中保存备用。

终止液:0.18mol/L H2SO4。

1.2.2 标准样品的配制 将24mg/mL的标准牛IgG进行稀释，得到质量浓度为0(空白)、7.8、15.625、31.25、62.5、125、250、500、1000、5000ng/mL的牛IgG标准样品。

1.2.3 样品预处理 取100mL水牛初乳，常温下4000r/min离心30min，除去上层的脂肪，用20%的盐酸调pH至4.6，静置20min后，常温下4000r/min离心20min，过滤，滤液用1mol/L的NaOH调pH至8.0，100mL容量瓶定容，用样品稀释液稀释一定倍数后待检。

1.2.4 测定方法 将ELISA试剂盒中的包被抗体稀释100倍，加100μL至每个孔，室温下(20～25℃)反应1h，板清洗5次(每次振荡2～3s后静置3min，用力甩干，下同)，加200μL封闭液至每个孔，室温下反应30min，板清洗5次，加100μL标准样品或者样品至每个孔，室温反应1h，板清洗5次，加100μL稀释105倍的HRP酶标二抗至每个孔，室温反应1h，板清洗5次，加100μL TMB底物液至每个孔，将酶标板在暗处放置，室温反应10～15min，加100μL终止液至每个孔以终止反应，将酶标板于酶标仪450nm下测定吸光度值。每个样品测定三次，取平均值。

2 结果与讨论

2.1 最适酶标二抗稀释倍数的确定

实验中，对酶标二抗选择1∶10000、1∶50000、1∶100000、1∶200000、1∶500000五个稀释倍数，结果表明，采用1∶10000的稀释倍数，各孔吸光度值均大于1.8，而采用1∶500000，各孔吸光度值小于0.8。最终选择1∶100000为酶标二抗的稀释倍数。随着酶标二抗储存时间的延长，可适当降低稀释倍数以保证酶标二抗中酶的活性。不同的厂家生产的酶标二抗酶活性有差异，应根据试剂说明书来适当稀释二抗，以达到最佳实验条件。

2.2 标准曲线的绘制

配制质量浓度为0(空白)、7.8、15.625、31.25、62.5、125、250、500、1000、5000ng/mL的牛IgG标准样品，通过标准曲线来定量样品中的IgG。以标准样品浓度值的对数为Y轴，吸光度值为X轴绘制标准曲线，结果如图1所示。在标准样品浓度值为7.8～1000ng/mL范围内，标准曲线呈现较好的线性，质量浓度超过1000ng/mL后，标准曲线将不再呈线性。

图1 ELISA法测定牛IgG标准曲线

2.2 精密度

采用上述ELISA方法，连续测定同一稀释浓度水牛乳样品6次，以检测方法的精密度，结果表明，6次测定的吸光度值分别为0.386，0.366，0.334，0.375，0.373，0.353，IgG质量浓度 6次测定值 RSD为5.58%。详见表1。

2.3 回收率

将标准品牛 IgG加入到水牛乳中，采用上述ELISA方法，检测添加的标准品牛IgG的回收率。结果表明，平均回收率可达84.40%～96.71%，方法回收率高。详见表2。

表2 ELISA法测定牛IgG的回收率

2.4 水牛初乳中IgG的检测

随机选择三头产犊日期接近的麽拉水牛，从产犊后第一次挤奶开始采样，按照本所牛场对奶水牛的挤奶时间，每天上午、下午各采集一次，每次间隔时间约12h，连续采样10次，测定水牛乳中的IgG质量浓度。结果显示，麽拉水牛产犊后60h以内初乳中的IgG质量浓度显著高于常乳中的IgG水平，第一次挤奶的初乳中IgG质量浓度达到85mg/mL以上，产犊后36h以内初乳中IgG质量浓度均达到30mg/mL，60h以后，初乳中的IgG质量浓度降至10mg/mL以下，详见表3。

水牛乳中IgG质量浓度的变化趋势如图2所示。水牛乳中的IgG质量浓度在72h以内迅速降至常乳水平，这种下降趋势与中国北方黑白花水牛初乳类似［9］，但下降速度稍缓。麽拉水牛产犊后36h以内初乳中IgG质量浓度达到30mg/mL，是开发水牛初乳制品的优质奶源。

图2 麽拉水牛初乳中IgG质量浓度变化图

3 结论

本实验研究了用ELISA测定水牛初乳中IgG活性质量浓度的方法，所获得的标准曲线方程为γ= -0.2907x2+2.0819x+0.8689，相关系数R2=0.9937，线性范围在 7.8～1000ng/mL，回收率在 84.40%～96.71%之间。该方法速度快、特异性强、精密度和回收率高，达到了检测要求，可以用于水牛初乳中IgG的分析。

需要注意的事项:a.酶标二抗的稀释倍数对标准品以及样品检测中吸光度值的影响较大，过高的稀释倍数会使测定吸光度值偏低甚至不显色，过低的稀释倍数会导致样品及标准品的吸光度值过高，检测中标准品的最低浓度的吸光度值应该高于背景值，最高浓度的吸光度值应该小于1.8～2.2，以此为标准来确定酶标二抗的稀释倍数。b.缓冲液最好为新鲜配制，或在低温下短时间内储藏，在测定之前需用pH计进行校正，配制缓冲液的水必须为超纯水或者双蒸水，缓冲液配制失误将会对实验结果产生严重影响。c.样品前处理对测定结果的影响尤为显著，牛初乳中主要的干扰物为脂肪及酪蛋白，必须除去脂肪以及酪蛋白，否则实验结果会发生较大偏差。样品、标准样品以及酶标二抗必须在加入酶标板孔之前再进行稀释。d.清洗必须严格按照操作程序，每次加入清洗液后，振荡2～3s，静置3min后，用力一次甩干。清洗不彻底或者清洗过程中造成的孔间的污染均会导致实验失败。

［1］RENNER E，SCHAAFSMA G，SCOTT KJ.Micronutrients in Milk［M］.New York:Elsevier Science Publishing Co Ine，1989: 1-70.

［2］HILPERT H，GERBER H，DEPEYER E，et al.Gastrointestinal passage of bovine Research anti-E.coil milk immunoglobulins in infants［J］.Nestle Research Neuns，1974，75:134-138.

［3］KUMMER A，KITTS DD，LI-CHAN E.Quantification of bovine IgG in milk using enzyme-linked immunosorbent assay［J］.Food and Agricultural Immunology，1992，4(2):93-102.

［4］HURLEY IP，COLEMAN RC，Ireland HE，et al.Use of sandwich IgG ELISA for the detection and quantification of adulteration of milk and soft cheese［J］.International Dairy Journal，2006，16(7):805-812.

［5］项新华，尹春君，赵丹慧，等.酶联免疫双抗体夹心法检测牛初乳素中免疫球蛋白IgG［J］.中国卫生检验杂志，2002，12 (2):137-138.

［6］侯芳妮，杜彦山，张志国，等.婴幼儿配方乳粉中IgG活性质量浓度的测定［J］.中国乳品工业，2009，37(1):54-57.

［7］PAUL K NAKANE，G BARRY PIERCE JR.Enzyme-labeled antibodies for the light and electron microscopic localization of tissue antigens［J］.The Journal of Cell Biology，1967，33(2):307 -318.

［8］ENGVALL E，PERLMANN P.Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Quantitative assay of immunoglobulin G［J］. Immunochemistry，1971，8(9):871-874.

［9］张和平，郭军，李立民，等.牛初乳中免疫球蛋白的测定［J］.中国乳品工业，2001，29(2):22-24.

Detection of IgG in buffalo colostrum by sandwich ELISA

LI Ling，ZENG Qing-kun*，TANG Yan
(Buffalo Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530001，China)

A quick and exact sandwich ELISA was developed for the detection of IgG in buffalo colostrum.The result showed that a good linear relationship existed between the logarithm of IgG concentration and absorbance values，the calibration curve of sandwich ELISA of IgG was γ=-0.2907x2+2.0819x+0.8689，R2was 0.9937，the linear range was 7.8～1000ng/mL，the average recovery was 84.40%～96.71%.The sandwich ELISA of IgG was highly sensitive and reproducible，which made it suitable for detecting IgG in buffalo colostrum and its product.

ELISA;buffalo colostrum;IgG

TS207.3

A

1002-0306(2011)03-0382-03

免疫球蛋白G(IgG)是牛初乳中主要的免疫活性物质，占牛初乳免疫球蛋白的80%以上［1］。1977年，Hilpert等［2］将牛IgG添加于婴幼儿配方乳粉中，发现其能增强配方乳粉的母乳特性。此后，牛IgG在增强抑菌以及免疫调节等多方面的功效也逐渐被研究证实。目前，牛IgG的检测方法主要有单向免疫扩散法、琼脂双扩散法、火箭免疫电泳法、酶联免疫吸附法(ELISA)、高效液相色谱法等，其中，酶联免疫法以其特异性强、准确性高等特点得到国内外研究者的广泛认可［3-6］。免疫酶技术是上世纪60年代末期发展起来的一种免疫检测方法，1966年Nakene等［7］首先提出免疫酶技术的基本原理。1971年Engvall等［8］采用ELISA方法测定IgG含量，使免疫酶技术成为一种实用的检测技术。而今，ELISA方法已经广泛用于检测体液(如血清)、分泌物(如唾液，乳汁)、排泄物(如尿液，粪便)，以及功能性食品中的某些特异性抗原或者抗体。ELISA方法常用的有:间接法、夹心法和竞争法三种。本研究采用适用于检验各种蛋白质等大分子抗原的双抗体夹心ELISA方法进行实验，以探索一种快速、准确测定水牛初乳中IgG活性质量浓度的方法，为水牛初乳及相关产品的检测、鉴定提供依据。

2010-02-01 *通讯联系人

李玲(1984-)，女，硕士，研究方向:乳品科学与技术。