陈南南，徐 歆，阎永贞，李卫芬，*，黄 琴，陈有亮，周绪霞

(1.浙江大学动物科学学院饲料科学研究所教育部动物分子营养学重点实验室，浙江杭州310029; 2.浙江大学动物科学学院动物产品加工实验室，浙江杭州310029)

常用防腐剂对西式火腿肠主要腐败菌抑菌作用的研究

陈南南1，徐 歆1，阎永贞1，李卫芬1，*，黄 琴1，陈有亮2，周绪霞1

(1.浙江大学动物科学学院饲料科学研究所教育部动物分子营养学重点实验室，浙江杭州310029; 2.浙江大学动物科学学院动物产品加工实验室，浙江杭州310029)

目的:测定常用食品防腐剂对西式火腿主要腐败菌的抑制作用。方法:采用微量稀释法测定不同防腐剂对木糖葡萄球菌、地衣芽孢杆菌和雷氏普罗威登菌的最小抑菌浓度(MIC)。结果:对于木糖葡萄球菌(G+)，抑菌效果最好的是Nisin和ε-聚赖氨酸，MIC均为12.5μg/mL;对于地衣芽孢杆菌(G+)，抑菌效果最好的是D-异抗坏血酸钠、丙酸钙、柠檬酸和柠檬醛，MIC均为12.5μg/mL;对于雷氏普罗威登菌(G-)，抑菌效果最好的是过氧化氢和柠檬酸，MIC均为25μg/mL。结论:不同防腐剂对西式火腿肠主要腐败菌的抑制效果有所差异，应复配使用。

防腐剂，西式火腿肠，腐败菌，最小抑菌浓度(MIC)，抑菌作用

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

本实验所用菌株 均为本实验室从腐败变质的西式火腿肠中分离纯化所得，实验菌株及其培养基见表1;柠檬酸、柠檬醛、脱氢醋酸钠、山梨酸钾、红曲色素、D-异抗坏血酸钠、尼泊金复合酯钠、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸甲酯、双乙酸钠、苹果酸 杭州大好家添加剂有限公司，食品级;乳酸钠、30%过氧化氢、丙酸钙 浙江大学设备科，分析纯;乳酸链球菌素(Nisin) 浙江银象生物工程有限公司惠赠，食品级;硫酸鱼精蛋白 上海楷洋生物技术有限公司，分析纯;溶菌酶 杭州中香化学有限公司，食品级;那西肽 杭州汇能生物技术有限公司，分析纯;壳聚糖 杭州华东医药股份有限公司，分析纯;纳它霉素、ε-聚赖氨酸 北京东方瑞德公司，分析纯。

AB204-N普及型分析天平、320 pH计 瑞士Mettler Toledo公司;722型分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司;超声波破碎仪 美国Sonic公司;电子数显恒温培养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司;Multiscan MK3酶标仪 芬兰Thermo公司。

表1 微生物培养基及培养条件

1.2 实验方法

1.2.1 防腐剂母液的配制及其倍比稀释 乳酸钠、双乙酸钠、山梨酸钾、丙酸钙、柠檬酸、柠檬醛、苹果酸、D-异抗坏血酸钠、脱氢醋酸钠和ε-聚赖氨酸溶液:称取1.28g试剂，无菌水溶解，定容至100mL，摇匀，4℃备用。

过氧化氢溶液:量取30%过氧化氢4.27mL，无菌水稀释，定容至100mL，摇匀，4℃备用。

对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸甲酯和尼泊金复合酯钠溶液:称取1.28g试剂，无水乙醇溶解，定容至100mL，摇匀，4℃备用。

Nisin、硫酸鱼精蛋白、溶菌酶和那西肽溶液:称取1.28g试剂，冰醋酸溶解，定容至100mL，摇匀，4℃备用。

壳聚糖溶液:称取1.28g壳聚糖，稀盐酸溶解，定容至100mL，摇匀，4℃备用。

倍比稀释:取11支EP管，每管加入0.5mL无菌水，在第1管加入0.5mL母液，混匀，吸取0.5mL混合液至第2管，混匀，再吸取0.5mL混合液至第3管，如此反复操作直至第11管，浓度依次为6400、3200、1600、800、400、200、100、50、25、12.5、6.25μg/mL。

1.2.2 菌液制备 本实验采用细菌生长法。将三种腐败菌置于各自的选择性培养基上进行培养24h，用接种环挑取典型形态的供试菌落，接种于5mL LB液体培养基中，37℃，200r/min，培养2～6h至对数生长期。取适量菌液，用LB液体培养基调整浓度至105cfu/mL。

1.2.3 MIC测定 无菌条件下，依次将不同防腐剂的各倍比稀释溶液按稀释度从低到高加入到无菌96孔板的第1列至第11列，每孔50μL，每个稀释度3个重复，第12列为阳性对照，加等量无菌水。随后每孔再加入50μL菌液，密封混匀。此时，第1列至第11列防腐剂终浓度分别为3200、1600、800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125μg/mL。用酶标仪测定0h的OD630值，然后将96孔板置于30℃培养箱中培养24h，再次测定OD630值。通过对比0h与24h时菌液的OD630值，确定不同防腐剂对各主要腐败菌的MIC，以此衡量抑菌效果。

2 结果与分析

各种常用食品防腐剂对西式火腿肠的主要腐败菌的抑制作用见表2。

表2 不同防腐剂对西式火腿肠主要腐败菌的MIC

由表2可见，在本抑菌实验中所用的20种防腐剂中，大部分防腐剂仅对一种或二种受试菌抑制效果较好，而对三种受试菌均具有良好抑菌效果(MIC≤200μg/mL)的只有4种，柠檬酸、柠檬醛、脱氢醋酸钠和ε-聚赖氨酸。对于木糖葡萄球菌(G+)，抑菌效果最好的是Nisin和ε-聚赖氨酸，MIC为12.5μg/mL;其次是硫酸鱼精蛋白、溶菌酶和那西肽，MIC均为25μg/mL;再次是柠檬醛和脱氢醋酸钠，MIC均为50μg/mL;较差的有乳酸钠和山梨酸钾，MIC均为1600μg/mL;最差的是丙酸钙、对羟基苯甲酸甲酯，MIC均为3200μg/mL。对于地衣芽孢杆菌(G+)，抑菌效果最好的是丙酸钙、柠檬酸、柠檬醛和D-异抗坏血酸钠，MIC均为12.5μg/mL;其次是山梨酸钾和脱氢醋酸钠，MIC均为25μg/mL;再次是双乙酸钠、硫酸鱼精蛋白、ε-聚赖氨酸和那西肽，MIC均为50μg/mL;较差的是壳聚糖，MIC均为3200μg/mL;最差的是过氧化氢，其在本次实验的浓度范围内未能表现出抑菌作用。对于雷氏普罗威登菌(G-)，抑菌效果最好的是过氧化氢和柠檬酸，MIC均为25μg/mL;其次是柠檬醛，MIC为50μg/mL;再次是ε-聚赖氨酸，MIC为100μg/mL;较差的是那西肽，MIC分别为3200μg/mL;最差的是Nisin、D-异抗坏血酸钠和溶菌酶，它们在本次实验的浓度范围内未能表现出抑菌作用。

3 讨论

3.1 Nisin

Nisin对许多G+菌，包括葡萄球菌、李斯特氏菌、链球菌、微球菌、分枝杆菌、棒杆菌和乳杆菌等，具有明显的抗菌活性;一些产孢子的G+菌，如芽孢杆菌、梭菌对Nisin尤其敏感，而它们的孢子比营养细胞更敏感;但Nisin对G-菌、酵母菌和霉菌没有作用［2］。张百刚等［3］对Nisin的抑菌作用进行研究后发现，在相同的处理条件下，Nisin对枯草芽孢杆菌(G+)的抑菌效果最好，对金黄色葡萄球菌(G+)的抑菌效果也较好，但是对大肠杆菌(G-)的抑茵效果最差。本实验中，Nisin对木糖葡萄球菌(G+)与地衣芽孢杆菌(G+)均表现出了很好的抑菌效果，而对雷氏普罗威登菌(G-)无抑菌作用。虽然本实验与前一实验所用菌种有所不同，但再一次证明了Nisin对G+菌具有优异的抑菌活性，但也存在对G-菌抑菌活性差的缺点。因此，在设计复配防腐剂配方时，可将Nisin与对G-菌具有良好抑菌活性的防腐剂进行组合。

3.2 山梨酸钾

在本实验中，山梨酸钾对地衣芽孢杆菌(G+)具有很强的抑菌活性，对雷氏普罗威登菌(G-)的抑菌活性一般，而对木糖葡萄球菌(G+)抑菌活性较差，这与前人的研究成果相符。裴家伟等［4］研究了山梨酸钾对5株羊肉腐败菌株的抑菌效果，结果表明，0.25‰以上山梨酸钾能够有效抑制105cfu/mL G+短芽孢杆菌的生长，但对G+球菌、G-螺旋菌和肠杆菌效果不明显。可见，山梨酸钾的抑菌作用具有一定的针对性和局限性，不宜单独用于肉与肉制品的防腐保鲜［5-6］。

3.3 柠檬酸和柠檬醛

本实验结果表明柠檬酸和柠檬醛具有广谱的抑菌作用，这与他人的报道较一致。石玉新发现柠檬酸对嗜水气单胞菌(G-)、副溶血弧菌(G-)和荧光假单胞菌(G-)的MIC分别为1100、800、1250μg/mL［7］。柠檬醛属于开链单萜，具有柠檬醛a(香叶醛)和柠檬醛b(橙花醛)两种顺反异构体，其对金黄色葡萄球菌(G+)、大肠杆菌(G-)、伤寒杆菌(G-)和痢疾杆菌(G-)有较高的抑菌活性［8］。林翠梧等报道毛叶木姜子叶油(含有柠檬醛)在1000μg/mL的情况下，可以完全抑制枯草杆菌(G+)、白葡萄球菌(G+)和四链球菌(G+)的繁殖，对大肠杆菌(G-)也有一定的抑制作用［9］。

3.4 硫酸鱼精蛋白

硫酸鱼精蛋白，又称精蛋白、鱼精蛋白、鱼精蛋白硫酸盐，是从成熟雄鱼的精囊组织中提取的一种低分子量强碱性蛋白，对G+菌、酵母菌、霉菌均有良好的抑菌活性，但对G-菌的抑制作用较差。王南舟等［10］研究发现鱼精蛋白对食品常见污染菌的生长有很强的抑制效果，MIC均在1000μg/mL以下，对G+菌效果更好。王陆玲等［11］的结果显示，鱼精蛋白对供试G+菌有很好的抑制作用，其MIC均小于100μg/mL，但对供试革兰氏阴性菌作用较弱，其 MIC均大于1500μg/mL，这与本实验结果相似。

3.5 脱氢醋酸钠和双乙酸钠

本实验中，脱氢醋酸钠对木糖葡萄球菌(G+)、地衣芽孢杆菌(G+)与雷氏普罗威登菌(G-)的MIC分别为50、25和200μg/mL，表明其是一种高效、广谱抑菌的食品防腐剂，这与黎婉园等的研究结果一致［12］。而肖红等［13］的研究表明，双乙酸钠需要较高浓度(25g/L)才对细菌有抑制作用，这可能与所用菌种及菌液初始浓度不同有关。

3.6 ε-聚赖氨酸

本实验中，ε-聚赖氨酸对三种西式火腿肠主要腐败菌的MIC均低于100μg/mL，表现出高效广谱的抑菌活性，这与前人的研究结果相符。秦芸桦等［13］的研究表明，ε-聚赖氨酸的抑菌谱很广，除枯草杆菌和蜡状芽孢杆菌对其的耐受性比较好外，其它细菌对其的敏感性均比较强，MIC都不高于25mg/L。李诚等［14］研究表明，ε-聚赖氨酸对大肠杆菌(G-)、金黄色葡萄球菌(G+)和保加利亚乳杆菌(G+)的MIC均为12.5mg/L，对枯草芽孢杆菌(G+)为25mg/L。值得注意的是，ε-聚赖氨酸作为新型的天然防腐剂，还具有水溶性好、安全性高、热稳定性好、抑菌pH范围广等优点［15］。

3.7 那西肽

那西肽属于含硫多肽类抗生素，由一种从阿根廷土壤中分离出的放射菌培养生成，对细菌等病原微生物有抑制、杀灭作用。周善湘等［15］比较了国产和进口那西肽的抑菌活性，发现两者抑菌效果一致，对葡萄球菌属、芽孢杆菌属、链球菌属及四联球菌属的14株革兰氏阳性菌均有明显的抑制作用，各菌的MIC均不高于1μg/mL，部分仅为0.001μg/mL;而对肠杆菌科、假单胞菌属及不动杆菌属等革兰氏阴性菌的抑制作用不理想，各菌的MIC＞125μg/mL。本实验中，那西肽对木糖葡萄球菌(G+)与地衣芽孢杆菌(G+)均表现出了较强的抑制作用，而对雷氏普罗威登菌(G-)的抑制作用很弱，这与前人的研究结果一致。综上所述，那西肽仅能有效抑制G+菌，因此适合与抗G-菌的防腐剂配合使用。

3.8 主要腐败菌对不同防腐剂的敏感性

G+菌和G-菌的结构差异表现在细胞壁上。G+菌细胞壁较厚，肽聚糖含量丰富，但组成简单，通透性较高;而G-菌细胞壁较薄，肽聚糖含量少，但组成复杂，包含磷脂、蛋白质和脂多糖(LPS)等成分，结构致密，仅允许分子量小于600的分子通过。由于细胞壁结构存在上述显著不同，导致这两类细菌在染色性、抗原性、毒性和药物敏感性等方面都存在很大的差异［17］。本实验中，不同防腐剂对主要腐败菌的MIC直接反映了主要腐败菌对不同防腐剂的敏感性。从实验结果不难发现，受试G+菌与G-菌对大部分防腐剂的敏感性确实存在一定的差异。可见，受试菌的细胞壁结构直接影响了防腐剂的抑菌效果。

虽然木糖葡萄球菌和地衣芽孢杆菌同属于G+菌，但两者对本实验所用防腐剂的敏感性也不尽相同。木糖葡萄球菌对Nisin、尼泊金复合酯钠、过氧化氢、硫酸鱼精蛋白、ε-聚赖氨酸、溶菌酶、那西肽和壳聚糖的敏感性高于地衣芽孢杆菌。在上述防腐剂中，仅尼泊金复合酯钠和过氧化氢是分子量小于200的化学防腐剂，其他皆为天然防腐剂，且分子量均在1000以上。而地衣芽孢杆菌对双乙酸钠、山梨酸钾、丙酸钙、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸甲酯、柠檬酸、柠檬醛、D-异抗坏血酸钠和脱氢醋酸钠较为敏感，这些防腐剂大多为分子量不超过220的化学防腐剂。可见，木糖葡萄球菌对分子量较高的天然防腐剂较为敏感，而地衣芽孢杆菌对分子量较低的化学防腐剂较为敏感，这可能与G+球菌和杆菌的细胞形态、结构及组成不同有关。

本实验中，对雷氏普罗威登菌具有良好抑菌效果(MIC≤200μg/mL)的防腐剂有对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸甲酯、过氧化氢、柠檬酸、柠檬醛和ε-聚赖氨酸6种，其中仅ε-聚赖氨酸为天然防腐剂，其他皆为化学防腐剂。而前文提及仅分子量小于600的分子能通过G-菌的细胞壁。因此推断，雷氏普罗威登菌对上述化学防腐剂敏感可能是由于它们的分子能穿透细胞壁而作用于细菌胞体。至于ε-聚赖氨酸，可能是以某种特殊的方式穿透雷氏普罗威登菌的细胞壁，其主要抑菌机理是抑制细菌的呼吸作用，同时作用于细胞膜和蛋白合成系统，与核糖体结合抑制蛋白和酶的合成，从而达到杀菌目的［15，18］。

4 结论

本实验测定了19种常用食品防腐剂对3种西式火腿主要腐败菌的MIC。对于木糖葡萄球菌(G+)，抑菌效果最好的是Nisin和ε-聚赖氨酸，MIC均为12.5μg/mL;对于地衣芽孢杆菌(G+)，抑菌效果最好的是D-异抗坏血酸钠、丙酸钙、柠檬酸和柠檬醛，MIC均为12.5μg/mL;对于雷氏普罗威登菌(G-)，抑菌效果最好的是过氧化氢和柠檬酸，MIC均为25μg/mL。同时，不同防腐剂对西式火腿肠主要腐败菌的抑制效果有所差异，应复配使用。以上实验结果可为后续的西式火腿肠安全复配型防腐剂的研制提供实验依据。

［1］Kostrzynska M，Bachand A.Use of microbial antagonism to reduce pathogen levels on produce and meat products:a review［J］.Can J Microbiol，2006，52(11):1017-1126.

［2］宋连花，王彦文.乳链菌肽(Nisin)研究进展［J］.食品研究与开发，2004，25(5):18-20.

［3］张百刚，高华.Nisin抑菌作用的研究［J］.中国乳品工业，2008(10):26-28.

［4］裴家伟，王敏，吴风亮，等.羊肉微生物相调查及山梨酸钾的防腐作用［J］.肉类研究，2007(8):30-34.

［5］江芸，周光宏，高峰，等.国产nisin在鲜猪肉保鲜中的应用［J］.食品科学，2001，22(12):74-77.

［6］张嫚，周光宏，徐幸莲.天然防腐剂与冷却牛肉保鲜相关特性的研究［J］.黄牛杂志，2005，31(1):31-34.

［7］石玉新，马艳丽，齐树亭.柠檬酸对三种常见水产病原菌的抑菌作用［J］.饲料工业，2005，26(6):57-59.

［8］肖勇，李良.木姜子属挥发油成分及其生物活性研究概况［J］.云南工业，2007，34(5):85-92.

［9］林翠梧，苏镜娱，曾陇梅，等.毛叶木姜子叶挥发油化学成分的研究［J］.中国药学杂志，2000，35(3):156-157.

［10］王南舟，钟立人，黄高雄，等.鱼精蛋白抗菌特性的研究［J］.食品科学，2000，21(4):43-46.

［11］王陆玲，金明晓，韩红梅，等.鱼精蛋白抑菌效果及在肠肉制品中的应用研究［J］.食品科学，2007，28(12):215-217.

［12］黎婉园，姚朔影，夏枫耿，等.脱氢醋酸钠及其抗菌性实验［J］.食品添加剂，2004，5(6):41-44.

［13］秦芸桦，周涛.聚赖氨酸抑菌特性研究［J］.安徽农业科学，2006，34(18):4740-4741，4758.

［14］李诚，石磊.ε-聚赖氨酸抑菌性能研究［J］.食品与发酵工业，2009，35(2):39-43.

［15］Shima S，Himyoshi M.Antimicrobial action of ε-poly-L-lysine［J］.J Antibiot，1984，11:1449-1455.

［16］周善湘，徐德标，周珮.国产和进口那西肽抑菌实验对照研究［J］.上海预防医学杂志，1994，5(6):16-17.

［17］李凡，刘晶星.医学微生物学［M］.第七版.北京:人民卫生出版社，2008:13.

［18］Kito M，Takimoto R，Yoshida T，et al.Purification and characterization of an ε-poly-L-lysine-degrading enzyme from an E-poly-L-lysine-producing strain of Streptomyces albulus［J］.Arch Microbiol，2002，178(5):325-330.

Study on bacteriostasis of common preservatives for major spoilage bacteria in western-style ham-sausages

CHEN Nan-nan1，XU Xin1，YAN Yong-zhen1，LI Wei-fen1，*，HUANG Qin1，CHEN You-liang2，ZHOU Xu-xia1
(1.Key Laboratory of Molecular Animal Nutrition Ministry of Education，Institute of Feed Science，College of Animal Science，Zhejiang University，Hangzhou 310029，China; 2.Laboratory of Animal Product Processing，College of Animal Science，Zhejiang University，Hangzhou 310029，China)

Objective:The bacteriostasis of common preservatives for major spoilage bacteria in western-style hamsausages was studied.Methods:The minimal inhibition concentration(MIC)of different preservatives for Staphylococcus xylosus，Bacillus licheniformis and Providencia rettgeri was determined by mean of micro-dilution assay.Results:The preservatives with the best inhibitory effect(MIC=12.5μg/mL)to Staphylococcus xylosus(G+cocci)were Nisin and ε-poly-L-lysine.The preservatives with the best inhibitory effect(MIC=12.5μg/mL)to Bacillus licheniformis(G+bacillus)were D-Sodium isoascorbiate，calcium propionate，citric acid and citral.The preservatives with the best inhibitory effect(MIC=25μg/mL)to Providencia rettgeri(G-bacillus)were hydrogen peroxide，citric acid and ε-poly-L-lysine.Conclusion:The bacteriostasis of common preservatives for major spoilage bacteria in western-style ham-sausages was irregular and it’s better to use compound preservatives.

preservative;western-style ham-sausages;spoilage bacteria;minimal inhibition concentration (MIC);bacteriostasis

TS202.3

A

1002-0306(2011)03-0343-04

微生物大量繁殖是引起食品腐败变质的最主要因素［1］。为了延长食品的保藏期，人们在食品加工过程采用各种手段使微生物丧失活性、延缓或阻止其生长。添加防腐剂是其中一种非常方便、有效的食品防腐方法，因而被普遍采用。食品防腐剂根据其来源和性质分为化学防腐剂和天然防腐剂两大类。随着科学技术的发展以及检测手段的完善，人们逐渐发现一些化学防腐剂存在诱癌性、致畸性和易引起食物中毒等问题。而天然防腐剂具有抗菌性强、安全无毒、水溶性好、热稳定性好、作用范围广等化学防腐剂无法比拟的优点，不但对人体健康无害，而且还具有一定的营养价值。因此开发高效、安全、稳定的天然防腐剂已成为食品科学研究的热点之一。目前已被国家批准使用的天然防腐剂有乳酸链球菌素(Nisin)、溶菌酶、ε-聚赖氨酸、壳聚糖等。本实验室分析了西式火腿肠主要腐败菌的菌相。结果发现，西式火腿肠在25℃下保存28d开始变质，主要腐败菌为:肠杆菌、假单胞菌、芽孢杆菌、葡萄球菌、弧菌和李斯特菌，分别占细菌总数的33%、14%、12%、9%、3%和0.9%，其中鉴定的腐败菌有9株，分别为雷氏普罗威登菌、鲍氏不动杆菌、普通变形杆菌、肺炎克雷伯菌、伤口埃希菌、河生肠杆菌、木糖葡萄球菌、浅金黄色单胞菌和地衣芽孢杆菌。并测定了19种常用食品防腐剂对木糖葡萄球菌、地衣芽孢杆菌和雷氏普罗威登菌3种西式火腿主要腐败菌的最小抑菌浓度(minimal inhibition concentration，MIC)，旨在为西式火腿肠安全复配型防腐剂的研制提供实验依据。

2010-02-25 *通讯联系人

陈南南(1982-)，男，硕士研究生，主要从事微生物方面的研究。

浙江省重大科研专项(2006C12066)。