李 强，唐 微，郑 伟，孙 剑

(郧阳医学院，湖北十堰442000)

杜仲粗多糖脱蛋白方法的对比研究

李 强，唐 微，郑 伟，孙 剑

(郧阳医学院，湖北十堰442000)

采用Sevag法、三氯乙酸法和盐酸法对杜仲粗多糖脱蛋白，并测定蛋白质脱除率、多糖损失率和总抗氧化能力损失率。结果表明，3%三氯乙酸脱蛋白效果较好且不影响多糖总抗氧化能力，此条件下，蛋白质脱除率为53.32%，多糖损失率为3.67%。

杜仲，多糖，脱蛋白，抗氧化能力

杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)广泛分布于陕西、甘肃、湖北等地，其树皮具有补肝肾、强筋骨、安胎等功效，是传统名贵中药材。多糖是杜仲皮的重要活性成分，具有增强免疫、肝损伤保护等作用［1-3］。脱除杂蛋白是多糖纯化的重要环节，相关研究常以蛋白质脱除率和多糖保留率为指标优选脱蛋白方法，而较少考虑多糖活性的变化［4-7］。FRAP法是一种评价天然产物总抗氧化能力的简便方法，原理是抗氧化物质能使Fe3+还原成Fe2+，后者可与菲啉类物质形成稳定的络合物，通过比色法可测出其抗氧化能力的高低［8］。目前，以FRAP法研究脱蛋白方法对多糖抗氧化能力的影响尚无报道。本实验以蛋白质脱除率、多糖损失率和总抗氧化能力损失率为指标，研究Sevag法、三氯乙酸法和盐酸法脱蛋白对杜仲多糖的影响，为纯化高抗氧化活性杜仲多糖奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

杜仲皮 购于十堰市中药材公司，产地湖北;考马斯亮蓝G-250 美国Amresco公司;牛血清蛋白美国Sigma公司;总抗氧化能力测定试剂盒 南京建成生物工程研究所;其他试剂 国产分析纯。

HH·SY11-Ni型电热恒温水浴锅 北京市长风仪器仪表公司;RE-52D型旋转蒸发器 上海青浦沪西仪器厂;722S型可见光分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;PHS-25型酸度计 上海雷磁仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 杜仲粗多糖的制备 药材60℃烘干4h，粉碎，过40目筛，加入15倍85%乙醇，82℃回流脱脂2h，真空抽滤并用85%乙醇洗6次，烘干备用。药粉加入水(料液比=1∶10)，于100℃水浴浸提2次，每次4h，提取液浓缩至1/18体积，加入3倍体积100%乙醇，4℃静置4h，4000r/min离心10min，沉淀依次用乙醇、丙酮、乙醚洗涤，干燥得杜仲粗多糖。称取3g粗多糖溶解并定容至500mL，得杜仲粗多糖溶液。

1.2.2 蛋白质含量测定 以考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量［9］。以牛血清蛋白(100mg/L)作标准曲线，595nm吸光度为横坐标，牛血清蛋白浓度为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程:y= 141.97x-1.1787，R2=0.9992。

1.2.3 多糖含量测定 以蒽酮-硫酸法测定多糖含量［10］。以葡萄糖(100mg/L)作标准曲线，620nm吸光度为横坐标，葡萄糖浓度为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程:y=142.93x+0.1662，R2=0.9997。

1.2.4 多糖总抗氧化能力测定 按总抗氧化能力测定试剂盒说明书操作。在37℃时，每分钟每毫升样品液使反应体系的吸光度值每增加0.01时，为一个抗氧化能力单位(U)。

1.2.5 蛋白质脱除率、多糖损失率和多糖总抗氧化能力损失率计算 见式(2)～式(4)。

式中:P1、R1、O1分别为原多糖液蛋白质含量、多糖含量和总抗氧化能力;P2、R2、O2分别为脱蛋白后多糖液蛋白质含量、多糖含量和总抗氧化能力。

1.2.6 Sevag法脱蛋白 取粗多糖溶液75mL于250mL三角瓶中，加水稀释至150mL，加入0.2倍体积氯仿和0.04倍体积正丁醇，用磁力搅拌器搅拌30min，4000r/min离心10min，取少量上层清液进行测定，剩余上层清液再加入0.2倍体积氯仿和0.04倍体积正丁醇，重复操作数次。

1.2.7 三氯乙酸法脱蛋白 取粗多糖溶液10份各20mL于50mL烧杯中，以1∶1体积加入三氯乙酸溶液，使其终浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%，搅匀，4℃静置12h，4000r/min离心10min，上清液定容至50mL进行测定。

1.2.8 盐酸法脱蛋白 取粗多糖溶液6份各20mL于50mL烧杯中，分别加入20mL水并用0.2mol/L盐酸调pH至2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5，混匀，4℃静置12h，4000r/min离心10min，上清液定容至50mL进行测定。

2 结果与分析

2.1 Sevag法脱蛋白结果

由图1可知，随着Sevag法处理次数的增加，蛋白质脱除率、多糖损失率和多糖总抗氧化能力损失率均逐渐升高。Sevag法处理1次，蛋白质脱除率为12.05%，多糖总抗氧化能力无损失，多糖损失率为46.14%，说明许多与蛋白质结合的多糖被除去，这部分多糖无抗氧化作用，再增加处理次数，蛋白质脱除率升高幅度远高于多糖损失率和总抗氧化能力损失率，说明较多游离蛋白被脱除。Sevag法处理6次后蛋白质脱除率达最高为 32.82%，多糖损失率为47.97%，总抗氧化能力损失率为11.11%。

图1 Sevag法脱蛋白的结果

2.2 三氯乙酸法脱蛋白结果

由图2可知，随着三氯乙酸浓度的增加，多糖损失率和总抗氧化能力损失率大致呈上升趋势;蛋白质脱除率未随三氯乙酸浓度增加而逐渐升高。三氯乙酸为有机酸，可使蛋白质变性并结合生成不溶性的盐类，同时，羧基的解离也改变溶液的pH，影响蛋白质的稳定性，所以蛋白质脱除率曲线出现多个拐点。三氯乙酸浓度为3%时，蛋白质脱除率为53.32%，多糖损失率为3.67%，总抗氧化能力无损失;三氯乙酸浓度升高至8%时，蛋白质脱除率达最高为58.48%，此时多糖损失率为5.07%，总抗氧化能力损失率为16.67%，说明高浓度三氯乙酸对多糖结构破坏较强，所以三氯乙酸浓度为3%较宜。

图2 三氯乙酸法脱蛋白的结果

2.3 盐酸法脱蛋白结果

由图3可知，随着多糖溶液pH降低，蛋白质脱除率逐渐升高，多糖损失率逐渐增加后又降低，总抗氧化能力损失率大致呈升高趋势。pH为2.0时，蛋白质脱除率达最高为55.67%，多糖损失率为9.18%，总抗氧化能力损失率为13.89%。pH为2.5时，蛋白质脱除率为54.01%，多糖损失率为20.42%，总抗氧化能力损失率为8.33%。pH为2.5时，蛋白质脱除率略低于pH 2.0时，多糖损失率也较pH 2.0时高，但总抗氧化能力损失率较低，说明抗氧化多糖保得留更多，所以pH为2.5较宜。

图3 盐酸法脱蛋白的结果

2.4 三种方法综合比较

将三种脱蛋白方法结果进行综合比较，由图4可知，三氯乙酸法蛋白质脱除率略低于盐酸法，远高于Sevag法，但多糖损失率和总抗氧化能力损失率均比后两种方法低，说明此条件下多糖活性结构不被破坏同时大部分蛋白质也被脱除，所以更适于杜仲粗多糖脱蛋白。

3 结论

脱除蛋白质是多糖纯化的必要环节，合理的脱蛋白方法应较少影响多糖的活性。本实验对三种脱蛋白方法进行对比研究，结果表明，蛋白质脱除率最高的是盐酸法，而多糖损失率和总抗氧化能力损失率最小的是三氯乙酸法。综合考虑蛋白质脱除率、多糖损失率和总抗氧化能力损失率，采用3%浓度三氯乙酸脱除杜仲粗多糖蛋白质较宜，蛋白质脱除率为53.32%，多糖损失率为3.67%，总抗氧能力此条件下无损失。

图4 三种脱蛋白方法综合比较

［1］ Gonda R，Tomoda M，Shimizu N，et al.An acidicpolysaccharide having activity on the reticuloendothelial system from the bark of Eucommia ulmoides［J］.Chem Pharm Bull，1990，38(7):1966-1969.

［2］Tomoda M，Gonda R，Shimizu N，et al.A reticuloendothelial system-activating glycan from the barks of Eucommia ulmoides［J］.Phytochemistry，1990，29(10):3091-3094.

［3］辛晓明，郭桂丽，王浩，等.杜仲多糖对环磷酰胺致小鼠毒性的影响［J］.时珍国医国药，2009，20(7):1664-1665

［4］秦卫东，马利华，陈学红，等.生姜多糖的提取及脱蛋白研究［J］.食品科学，2008，29(4):218-220.

［5］刘凤，陶慧卿，何培民.条斑紫菜多糖脱蛋白方法与条件优化［J］.上海水产大学学报，2007，16(2):140-143.

［6］张慧玲，任秀莲，魏琦峰，等.海带多糖的脱蛋白研究［J］.中成药，2008，30(9):1370-1373.

［7］毛英丽，王忠民，李瑾瑜，等.葡萄多糖脱蛋白方法的研究［J］.食品研究与开发，2008，29(4):42-44.

［8］李秋红，李廷利，黄莉莉，等.中药抗氧化的作用机理及评价方法研究进展［J］.时珍国医国药，2008，19(5):1257-1258.

［9］李合生，孙群，赵世杰，等.植物生理生化实验原理和技术［M］.北京:高等教育出版社，2000:182-185.

［10］王宪泽.生物化学实验技术原理和方法［M］.北京:中国农业出版社，2002:52-54.

Study on the comparison of different methods for deproteinization from crude polysaccharide of Eucommia ulmoides Oliver

LI Qiang，TANG Wei，ZHENG Wei，SUN Jian
(Yunyang Medical College，Shiyan 442000，China)

Sevag method，Trichloroacetic acid method and HCl method were used to remove protein from crude polysaccharide of Eucommia ulmoides Oliver and the percentage of deproteinization，the loss of polysaccharide and the loss of total antioxidant ability(TAA)were determined.The results showed that with concentration of trichloroacetic acid 3%，deproteinization was effective and TAA didn’t change.In this condition，the percentage of deproteinization was 53.32%，the loss of polysaccharide was 3.67%.

Eucommia ulmoides Oliver;polysaccharide;deproteinization;antioxidant ability

TS201.2+3

B

1002-0306(2011)03-0316-03

2010-03-22

李强(1979-)，男，硕士，讲师，从事生物活性成分研究。

郧阳医学院科研基金资助项目(2006QDJ06)。