郭 睿，曹雁平，施 宇，曹 杨，张 婷

(1.北京工商大学化学与环境工程学院，北京100048; 2.北京工商大学北京市高校食品添加剂与配料工程研究中心，北京100048)

从肝素生产废弃物中分离纯化硫酸皮肤素

郭 睿1，曹雁平2，*，施 宇1，曹 杨1，张 婷1

(1.北京工商大学化学与环境工程学院，北京100048; 2.北京工商大学北京市高校食品添加剂与配料工程研究中心，北京100048)

筛选了乙醇、丙醇、丙酮三种有机试剂对肝素生产废弃物进行分级沉淀，对比了添加钠离子浓度对分级沉淀的影响。凝胶成像仪对各沉淀级分的醋酸纤维素薄膜电泳结果进行分析，确定了各级分的黏多糖构成比例，表明丙酮法级分14和15的硫酸皮肤素含量占黏多糖组成比例的100%，随后通过DEAE-650S弱离子交换层析进一步分离，得到了高纯度的硫酸皮肤素，高效凝胶渗透色谱法测定该产品纯度为93.27%。

分级沉淀，硫酸皮肤素，离子交换层析，黏多糖，分离纯化

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

肝素生产废弃物 高安市，江西时通实业有限公司;乙醇、丙醇、丙酮、氯化钠、三氯甲烷、甲醇 分析纯，北京试剂;甲苯胺蓝、阿利新蓝8GX 分析纯，Amresco;醋酸纤维素薄膜(7cm×9cm) 北京六一厂;TOYOPEARL DEAE-650STOSOH公司;硫酸皮肤素、肝素、硫酸软骨素标准品 Sigma公司。

CR 22G高速冷冻离心机 日本Himac;DYCP-38B电泳仪 北京六一厂;Alliance 2695高效液相色谱仪 美国Waters公司;ImageQuant 300凝胶成像仪、AKTA prime蛋白纯化系统 美国GE公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理［6］将生产肝素废液用乙醇沉淀、干燥并粉碎，按固液比1∶25加入脱脂液甲醇/三氯甲烷(V/V，1∶1)，搅拌24h后真空抽滤，保留固体，冻干。取冻干固体，用去离子水按固液比1∶10充分溶解，12000r/min，20℃离心15min，保留上清液，向上清液中加入3V体积的无水乙醇，4℃静置24h，12000r/min，20℃离心20min，保留沉淀，冻干。

1.2.2 分级沉淀有机试剂的筛选 有机试剂沉淀法作为纯化生物大分子物质的一种经典方法，选择有机溶剂时应能和水混溶，使用较多的有机溶剂如乙醇、丙醇、丙酮等，为避免生物活性大分子变性失活，沉淀应在低温下进行。

分别选取乙醇、丙醇和丙酮作为沉淀剂，取预处理后的样品按固液比1∶10溶解于去离子水中，加入0.1V体积的沉淀剂，摇匀20min，4℃密封静置24h。离心12000r/min，20min，4℃，取出沉淀并用20mL去离子水冲洗、冻干。再向上清液中加入0.1V原溶液体积的沉淀剂，重复上述操作，直至加入沉淀剂时连续5次无沉淀产生。取各次沉淀溶解后进行醋酸纤维素薄膜电泳检测。

1.2.3 钠离子浓度对分级沉淀的影响 考虑到溶液中金属离子浓度可能对分级沉淀的级分数量、各级分回收率和黏多糖组成比例产生影响，本文选取了添加2%的NaCl(浓度)进行对比。分别选取乙醇、丙醇和丙酮作为沉淀剂，在第一次加入沉淀剂前向溶解后的样品中添加2%的NaCl(浓度)溶解，之后步骤同1.2.2。

1.2.4 各沉淀级分黏多糖组成分析

1.2.4.1 醋酸纤维素薄膜电泳［7-8］采用醋酸纤维素薄膜电泳法对不同级分的黏多糖组成进行分析，条件为0.1mol/L乙酸钡缓冲液(pH8.6)，电压100V、电流4mA，电泳时间3h。电泳完毕后，用0.1%甲苯胺蓝溶液染色30min，1%醋酸脱色30min。

1.2.4.2 黏多糖组成比例分析［9-10］采用 GE IQ300凝胶成像仪对电泳结果进行成像，使用IQ TL软件对电泳结果进行分析，确定不同级分的黏多糖组成比例。条件为apture4，zoom15，focus1.2，auto contrast。

1.2.5 离子交换层析与洗脱液DS的监测 离子交换层析可以使分级沉淀法得到的单一黏多糖组分进一步纯化，阳离子染料阿利新蓝8GX可以与硫酸皮肤素聚阴离子发生特异反应，引起染料吸收光谱的变化，从而可以用于洗脱时硫酸皮肤素的监测。

1.2.5.1 离子交换层析［11-12］选用DEAE-650s弱阴离子交换树脂装柱，洗脱液A为超纯水，洗脱液B为2mol/L NaCl溶液，用A液平衡柱子，将沉淀法得到的单一DS组分样品溶解，上样，洗脱条件为100%A至100%B梯度洗脱，洗脱时间 400min，流速1mL/min，收集6min/管。

1.2.5.2 洗脱液DS的监测［13-14］配制阿利新蓝8GX溶液:275mg阿利新蓝8GX溶解于15%磷酸-2%硫酸中，定容至250mL。洗脱液取样0.2mL，加入1.4mL 8GX溶液和1.2mL去离子水，混匀，静置5min，于480nm下测定吸光值。

将峰所在的管数合并，透析脱盐，冻干，进行HPGPC纯度测定。

1.2.6 纯度测定［14-15］硫酸皮肤素纯度测定采用HPGPC高效凝胶渗透色谱法。色谱柱为TSK Gel 4000PWXL(7.5mm ID×30cm L)，流动相100%超纯水，进样量20μL，柱温箱30℃，流速0.4mL/min，示差折光检测器(Waters 2414)，检测器温度35℃。

2 结果与讨论

2.1 分级沉淀黏多糖的有机试剂筛选结果

2.1.1 乙醇法 通过乙醇法对处理后的原料进行分级沉淀，所得到的各级分电泳图见图1～图3。经过凝胶成像仪和IQ TL软件分析得到了乙醇法各级沉淀HEP、DS、CS所占黏多糖组分比例，见图4。

图1 乙醇法分级沉淀电泳图注:从左至右分别为0.7、0.8、0.9、1.0、1.1V，标品混合样。

图2 乙醇法分级沉淀电泳图注:从左至右分别为1.2、1.3、1.4、1.5、1.6V，标品混合样。

图3 乙醇法分级沉淀电泳图注:从左至右分别为1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2V，标品混合样。

图4 乙醇法各级沉淀HEP、CS、DS所占黏多糖组分比例

2.1.2 丙醇法 通过丙醇法对处理后的原料进行分级沉淀，所得到的各级分电泳图见图5。经过凝胶成像仪和IQ TL软件分析得到了丙醇法各级沉淀HEP、DS、CS所占黏多糖组分比例，见图6。

2.1.3 丙酮法 通过丙酮法对处理后的原料进行分级沉淀，所得到的各级分电泳图见图7～图9。经过凝胶成像仪和IQ TL软件分析得到了丙酮法各级沉淀HEP、DS、CS所占黏多糖组分比例，见图10。

图5 丙醇法分级沉淀电泳图注:从左至右分别为0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1V，标品混合样。

图6 丙醇法各级沉淀HEP、DS、CS所占黏多糖组分比例

图7 丙酮法分级沉淀电泳图注:从左至右分别为0.7、0.8、0.9、1.0、1.1V，标品混合样。

图8 丙酮法分级沉淀电泳图注:从左至右分别为1.2、1.3、1.4、1.5、1.6V，标品混合样。

图9 丙酮法分级沉淀电泳图注:从左至右分别为1.7、1.8、1.9、2.0、2.1V，标品混合样。

2.1.4 乙醇、丙醇、丙酮法各级分回收率变化 将乙醇、丙醇、丙酮法的各级分回收率作图，见图11。

图10 丙酮法各级沉淀HEP、DS、CS所占黏多糖组分比例

图11 各级分回收率变化图

2.1.5 数据分析 由图4、图11得出，乙醇法在0.1～0.6V时未产生沉淀。HEP在乙醇法中首先沉淀的是黏多糖，第6、7、8次级分，HEP的含量占三种黏多糖总量的100%，而随后10～22次级分中，HEP含量逐步下降，最终消失。DS、CS在各级分中含量的变化则相对较小。2.1V时得到了所有级分中CS含量的最高值73.6%。

由图11可知，丙醇法所得级分数量较少，在0.1～0.5V以及1.2V以后均不产生沉淀。未能得到某种单一黏多糖含量较高的级分，所得级分的数量可能和三种黏多糖的分离能力成反比。

由图10、图11可知，丙酮法在0.1～0.6V没有沉淀产生，0.7～0.8V小范围区间时得到了比例为100%的HEP，1.4～2.1V之间HEP含量保持在较低范围内，1.4～1.5V的小范围区间内得到了比例为100%的DS，回收率分别为2.6%和2.5%。该法的主要级分回收集中在1.1～1.6V，该区间回收率达到总有效回收率的88.3%。

乙醇法所生成沉淀次数明显多于丙醇法和丙酮法，乙醇法、丙醇法、丙酮法分别在1.3、0.8、1.1V时沉淀量达到最大值，乙醇法的总回收率76.1%略高于丙酮法的73.7%和丙醇法的72.7%。

2.2 钠离子浓度对分级沉淀的影响

2.2.1 乙醇法 通过向沉淀前原溶液中添加钠离子浓度，使用乙醇法对处理后的原料进行分级沉淀，所得到的各级分电泳图见图12。经过凝胶成像仪和IQ TL软件分析得到了乙醇法各级沉淀HEP、DS、CS所占黏多糖组分比例，见图13。

2.2.2 丙醇法 通过向沉淀前原溶液中添加钠离子浓度，使用丙醇法对处理后的原料进行分级沉淀，所得到的各级分电泳图见图14。经过凝胶成像仪和IQ TL软件分析得到了丙醇法各级沉淀HEP、DS、CS所占黏多糖组分比例，见图15。

2.2.3 丙酮法 通过向沉淀前原溶液中添加钠离子浓度，使用丙醇法对处理后的原料进行分级沉淀，所得到的各级分电泳图见图16。经过凝胶成像仪和IQ TL软件分析得到了丙酮法各级沉淀HEP、DS、CS所占黏多糖组分比例，见图17。

图12 乙醇法分级沉淀电泳图注:从左至右分别为0.6、0.7、0.8、0.9、1.0V，标品混合样。

图13 乙醇法各级沉淀HEP、DS、CS所占黏多糖组分比例

图14 丙醇法分级沉淀电泳图注:从左至右分别为0.6、0.7、0.8、0.9V，标品混合样。

图15 丙醇法各级沉淀HEP、DS、CS所占黏多糖组分比例

图16 丙酮法分级沉淀电泳图注:从左至右分别为0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1V，标品混合样。

2.2.4 乙醇、丙醇、丙酮法各级分回收率变化 将乙醇、丙醇、丙酮法的各级分回收率作图，见图18。

图17 丙酮法各级沉淀HEP、DS、CS所占黏多糖组分比例

图18 各级分回收率变化图

2.2.5 数据分析 由图13、图15、图17、图18可知，乙醇法在0.1～0.5V时未产生沉淀。0.6～1.0V时，级分中HEP的比例呈较明显的下降趋势，而CS则呈较明显的上升趋势。丙醇法所得级分数量最少，从0.6～0.9V，仅为4次。丙酮法在0.1～-0.5V不产生沉淀，未能得到组分单一的黏多糖，在0.6V时得到CS的含量占三种黏多糖总量的68%。

可见，溶液中的钠离子浓度对有机试剂分级沉淀法分离黏多糖分离效果的影响很大。在分离纯化应用过程中应该避免金属离子浓度对分离效果的负面影响，金属离子浓度不宜过高，以提高分离效果。

将三种方法各级分回收率作图，见图12。乙醇法、丙醇法、丙酮法所生成沉淀次数相差不多，但乙醇法和丙酮法均比不添加钠离子浓度时减少一半以上。三种方法分别在0.7、0.7、0.6V时沉淀量达到最大值，乙醇法的总回收率83.9%略高于丙酮法的81.9%和丙醇法的80.3%，均比不添加钠离子浓度的总回收率要高，这可能是由于沉淀次数的减少，减少了在清洗沉淀时所不可避免的损失量。

2.3 讨论

有机溶剂的沉淀机理是降低水的介电常数，导致具有表面水层的黏多糖脱水，相互聚集，最后析出。采用有机试剂分级沉淀法进行分离纯化时，每一级分的得率和黏多糖组成比例都会有所不同，这可能是由于三种黏多糖的结构不同或所带电荷密度不同与空间结构的差异，或不同多聚糖在不同有机试剂以及不同浓度有机试剂中的溶解饱和度不同。

同时，在比较金属离子对分级沉淀的结果影响时，选取了钠离子作为比较，在初始溶液中添加一定钠离子浓度时，三种沉淀法所得到的级分数量不同，产生沉淀的次数减少近一倍，这可能是由于溶液中钠离子浓度的提高，降低了溶液的饱和浓度，加速了糖胺聚糖的沉淀，却降低了沉淀法的分离能力，未能得到单一含量较高的HEP、DS或CS。

2.4 标准品与原料的醋酸纤维薄膜电泳分析结果

将预处理后的原料、HEP标品、DS标品、CS标品以及三种标品的混合样进行醋酸纤维薄膜电泳后分析(图19)，原料中所含三种黏多糖，其比例为HEP 30.9%，DS 33.7%，CS 35.4%。同时也验证了该电泳方法可以很好地将三种黏多糖分离开，CS的迁移速度最快，HEP最慢，而DS则介于两者之间。

图19 标准品与原料电泳图注:从左至右分别为原料、HEP标品、DS标品、CS标品、标品混合样。

2.5 离子交换层析结果

离子交换树脂通过吸附与自身带电荷相反的物质，随后逐步改变洗脱液的离子强度，使之与树脂亲和力大小不同的物质得以分离。弱离子交换树脂可以很好地吸附硫酸皮肤素类的糖胺聚糖物质，并在高离子浓度时被洗脱下来。通过梯度提高洗脱液的离子浓度，被吸附的硫酸皮肤素在第8～16管内被洗脱(图20)，即所对应的洗脱浓度为0.24～0.48mol/L NaCl时，洗脱液中DS与阿利新蓝8GX发生特异反应，引起溶液吸光值上升，证明硫酸皮肤素在该区间内被洗脱下来，同时也去除了与树脂亲和力更强或更弱的杂质。

图20 离子交换层析-阿利新蓝8GX显色分光光度图

2.6 硫酸皮肤素纯度测定结果

通过HPGPC高效凝胶渗透色谱谱图(图21)可以看出，纯化后硫酸皮肤素的纯度为93.27%，在T= 28.647s和T=31.563s时出现两个小峰，表明硫酸皮肤素中夹带少量小分子物质，这可能是其自身降解生成的不饱和二糖，也可能是由于该类物质的吸水作用，存在着少量含羧基和硫酸基的小分子无机盐。因此通过谱图可进一步确定该样品为纯的硫酸皮肤素。

3 结论

实验得到了使用丙酮作为有机试剂进行分级沉淀，原料1∶10固液比水溶解，0.1V丙酮添加增量，4℃沉淀24h，级分14与15中DS含量占黏多糖组分的100%，随后在DEAE-650S离子交换层析中收集0.24～0.48mol/L NaCl洗脱液，透析并冻干，可得到纯度为93.27%的DS，是一种有效的手段。同时完成了乙醇法、丙醇法和丙酮法沉淀各级分糖胺聚糖的组分构成鉴定与添加钠离子浓度对纯化的影响，表明纯化时金属离子浓度不宜过高。以后研究重点可集中在如何分离出高纯度的硫酸软骨素，以及如何使目标产物的回收率提高。

图21 HPGPC高效凝胶渗透色谱谱图

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Purifying dermatan sulfate from the waste in heparin production

GUO Rui1，CAO Yan-ping2，*，SHI Yu1，CAO Yang1，ZHANG Ting1
(1.College of Chemical and Environmental Engineering，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China; 2.Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients，Beijing 100048，China)

Ethanol，propanol and acetone were screened in organic reagents fractional precipitation of the waste in heparin production，the addition of sodium ion concentration was also compared.Gel imaging system was used in analyzing the result of each fraction in fractional precipitation after cellulose acetate membrane electrophoresis and the composition of glycosaminoglycan in each fraction was identified.It indicated that 100%DS in GAGs percent was obtained in 14th and 15th fraction.After the purification of DEAE-650S weak ion-exchange chromatography，high purity of DS was obtained.The results of HPGPC showed purity of the product was 93.27%.

fractional precipitation;dermatan sulfate;ion-exchange chromatography;glycosaminoglycan; purification

TS201.2

B

1002-0306(2011)03-0224-06

硫酸皮肤素(dermatan sulfate，DS)，广泛存在于哺乳动物的结缔组织、皮肤、纤维软骨等组织中［1］。硫酸皮肤素的主体是由L-艾杜糖醛酸和N-乙酰基半乳糖胺-4-硫酸所形成的二糖单位的重复结构［2］，属于黏多糖(即糖胺聚糖，glycosaminoglycan，GAGs)的一种。其它糖胺聚糖类物质还包括肝素(heparin，HEP)和硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)等［3］。这些黏多糖均具有抗凝血［1］、抗炎［4］、抗肿瘤［5］等生物学活性。肝素生产废弃物往往被丢弃，从中分离纯化硫酸皮肤素不仅可以提高生产的附加价值，还能避免原材料的浪费，减少对环境的污染。与特异酶降解法、强阴离子交换层析法、季铵盐化合物沉淀法等传统分离黏多糖方法相比，有机试剂分级沉淀结合弱阴离子交换色谱法，不仅降低了制备成本和要求，还可得到高纯度的硫酸皮肤素，有望将硫酸皮肤素应用到更广的领域中。

2010-11-15 *通讯联系人

郭睿(1985-)，男，硕士研究生，研究方向:天然产物深加工。