林 燕，王鸿飞，李和生，刘 飞，毛方华

(宁波大学生物工程与生命科学学院，浙江宁波315211)

酶法水解鱿鱼皮制备多肽工艺的研究

林 燕，王鸿飞*，李和生，刘 飞，毛方华

(宁波大学生物工程与生命科学学院，浙江宁波315211)

分析了阿根廷鱿鱼皮的一般化学组成，并以其为原料，研究了酶的种类、加酶量、pH、温度及酶解时间对水解度(DH)的影响。采用正交实验对酶解工艺进行了优化，研究结果表明，复合蛋白酶水解鱿鱼皮制备多肽工艺的最适条件为:加酶量14000u/g、pH8.5、酶解温度50℃、酶解时间4h。在此条件下水解度可达20.7%。

鱿鱼皮，酶解工艺，优化

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鱿鱼 阿根廷鱿鱼，购自宁波江东水产市场，重量150～200g;木瓜蛋白酶(测定活力6.32×104U/g)、碱性蛋白酶(测定活力19.21×104U/g)、胃蛋白酶(测定活力3.56×104U/g) 上海楷洋生物工程有限公司;中性蛋白酶(13.08×104U/g) 广西南宁庞博生物工程有限公司;复合蛋白酶(测定活力12.97× 104U/g) 广州友志贸易有限公司;牛血红蛋白(BR) 上海蓝季科技发展有限公司;其他试剂 均为分析纯。

Cary-50紫外分光光度计 美国VARIAN公司; T6-新悦可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;WK-200B高效药物粉碎机 山东精诚机械有限公司;CS101-1AB电热鼓风干燥箱 重庆银河实验仪器有限公司;KDN-04消化炉 上海新嘉电子有限公司;SX2-4-10马弗炉 上海跃进医疗器械厂;R-201旋转蒸发仪 上海申顺生物科技有限公司;DK-S22电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司;PB-10pH计、BP-211D电子天平 德国sartorius公司;SZCL型数显智能控温磁力搅拌器巩义市中博仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程 鱿鱼皮粉→溶解→加酶酶解→灭酶→冷却→多肽液

1.2.2 操作要点

1.2.2.1 原料前处理 鱿鱼皮剪成小块置于铁丝网上，于50℃下鼓风烘干12～15h，最终水分含量控制在4.5%～5%，经高效药物粉碎机粉碎(1min/批)，得鱿鱼皮粉，密封于干燥器中，待用。

1.2.2.2 酶解 通过预实验，确定底物浓度为4%。称取一定量鱿鱼皮粉，溶解使底物浓度为4%，根据底物质量加酶，振荡混匀后在一定条件下酶解，酶解完成后沸水浴灭酶10min，冷却定容并进行水解度的测定。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 蛋白酶的选择 选取木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶，根据其活力选择不同的添加量，在各自最适的酶解条件下进行酶解，以水解度为指标确定最适的水解用酶。

1.2.3.2 加酶量的选择 每克底物分别添加8000、10000、12000、14000、16000、18000u的酶量，在pH6.5、温度45℃的条件下酶解4h，然后测定水解度，综合选定最适酶用量。

1.2.3.3 pH的选择 分别调节酶解体系pH为7.0、8.0、8.5、9.0、9.5，在45℃条件下酶解4h，测定水解度并确定最适pH。

1.2.3.4 温度的选择 在前面确定的最适条件下分别在40、45、50、55、60℃条件下酶解4h，确定最适酶解温度。

1.2.3.5 酶解时间的选择 对于选定的最适水解用酶，在相同的水解条件下酶解2、3、4、5、6h以确定最适酶解时间。

1.2.4 正交实验 在单因素实验的基础上采用正交实验对酶解工艺进行优化，其因素与水平见表1，按L9(34)正交表进行正交实验。

表1 正交实验因素水平表

1.2.5 测定方法

1.2.5.1 基本成分测定 总氮含量测定:凯氏定氮法(GB/T 5009.5-2003);水分含量测定:直接干燥法(GB/T 5009.3-2003);灰分含量测定:灼烧重量法(GB 5009.4-85);脂肪含量测定:索氏抽提法(GB/T 14772-2008)。

1.2.5.2 酶活力测定 福林-酚法。其中，木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶按SB/T 10317-1999测定;胃蛋白酶按中国药典2000版(第二部)测定。

1.2.5.3 水解度(DH)测定［14］甲醛电位滴定法。以游离氨基氮占总氨基氮的含量表示水解度，其公式为DH(%)=游离氨基酸氮总量/总氨基氮×100%

2 结果与讨论

2.1 鱿鱼皮的基本成分

鱿鱼皮的基本成分见表2。鱿鱼皮中含有大量水分，其干物质主要成分是蛋白质。通过测定其粗蛋白含量为73.9%(以干基重计)。

表2 鱿鱼皮的一般化学组成(湿基)

2.2 蛋白酶的选择

分别在每一种酶的适宜条件下进行酶解实验，结果见表3。

表3 不同酶的酶解效果酶种类 温度(℃) pH 水解度DH(%)

从表3可以看出，各种酶的水解程度为:复合蛋白酶＞中性蛋白酶＞胃蛋白酶＞碱性蛋白酶＞木瓜蛋白酶，其中复合蛋白酶的水解程度明显高于其余四种酶，木瓜酶水解度较低。因此，选用复合蛋白酶进行酶解工艺的水解用酶。

2.3 酶量对水解度的影响

根据选酶实验结果，选取复合蛋白酶进行后续实验。在pH6.5、温度45℃、酶解时间4h的条件下，研究不同酶量对水解度的影响，结果见图1。

图1 复合蛋白酶加酶量对水解度的影响

由图1可知，当复合酶量小于14000u/g时，随着酶量的增加，水解度不断升高;当复合酶量大于14000u/g后，水解度基本保持不变。

在酶法制取鱿鱼皮多肽时，酶的用量对鱿鱼皮蛋白的水解程度有显著的影响。一般地，随酶用量的增加水解程度也随之增加;但当水解到一定程度时，随底物浓度的下降、酶量的增加，水解度再不会提高。由图1表明，较小酶用量14000u/g时，就可达到较好的水解效果。

2.4 pH对水解度的影响

在加酶量14000u/g、温度45℃、酶解时间4h的条件下，研究不同pH对水解度的影响，结果见图2。

图2 pH对水解度的影响

由图2可知，酶解体系的pH对酶解效果有显著的影响。因为pH的大小直接影响酶的活力，每一种酶都有其适宜的pH范围。当pH小于8.5时，随pH的升高水解度增加;当pH大于8.5时，随pH的升高水解度降低;pH8.5时，水解度最高。表明复合蛋白酶在pH8.5时的弱碱性条件下对鱿鱼皮蛋白的水解达到了一个较好的效果，在过酸或过碱的环境下，复合蛋白酶的活性会受到不同程度的抑制，此外，不适宜的pH环境还会影响酶与其底物的结合，也会影响水解效果。

2.5 温度对水解度的影响

在加酶量14000u/g、pH8.5、酶解时间4h的条件下，研究不同温度对水解度的影响，结果见图3。

图3 温度对水解度的影响

由图3可知，温度对酶解效果有较显著的影响。不但影响水解反应，而且影响酶的活力。当温度低于50℃时，随温度的增加水解程度增高;当大于50℃时，水解度有所降低;在50℃时，有较高的水解度。在用复合蛋白酶水解鱿鱼皮蛋白时，可选用温度50℃作为水解温度。

2.6 酶解时间对水解度的影响

在加酶量14000u/g、pH8.5、温度50℃的条件下，研究不同酶解时间对水解度的影响，结果见图4。

一般地，随着作用时间的增加，水解度不断增加;但当达到一定时间后，随底物浓度的下降、水解产物的积累，水解度增加的程度变得不明显，为提高经济效益，此时为酶解最少的作用时间。由图4表明，在酶作用时间4h以下时，随时间的延长，水解度增高;当4h以后，水解度基本保持不变;在用复合蛋白酶水解鱿鱼皮蛋白时，可选用4h为酶解时间。

图4 酶解时间对水解度的影响

2.7 酶解工艺条件的优化

在单因素实验的基础上采用正交实验对酶解工艺进行优化，按L9(34)正交表进行正交实验，正交实验的结果见表4。

表4 复合蛋白酶水解鱿鱼皮正交实验的结果与分析

由极差分析(R值)可得，四个因素对复合蛋白酶水解度的影响依次为:B＞C＞A＞D，优化所得条件为:B2C2A3D2，即 pH8.5、温度 50℃、加酶量18000u/g、时间4h。但从极差分析的三个平均值(K值)来看，加酶量的后两个水平相差很小，也就是说增加4000u的酶量对其水解度的影响几乎可忽略不计，从经济上考虑，仍然选择14000u/g作为复合酶水解工艺的最适加酶量，在此条件下酶解鱿鱼皮所得水解度为20.7%。

3 结论

对阿根廷鱿鱼皮的一般组成进行了测定并对其酶解工艺进行了研究。通过酶的选择，确定了复合蛋白酶作为适合的鱿鱼皮制取多肽用酶。通过单因素及正交实验，研究表明，复合蛋白酶酶解鱿鱼皮的最适工艺条件为:pH8.5、温度50℃、加酶量14000u/g(干基)、水解时间4h，在此条件下能得到较高的水解度。

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Study on the enzymatic hydrolysis technology of squid skin(Illex argentinus)peptides

LIN Yan，WANG Hong-fei*，LI He-sheng，LIU Fei，MAO Fang-hua
(College of Bioengineering and Life Science，Ningbo University，Ningbo 315211，China)

General chemical composition of squid skin(Illex argentinus)were analyzed.The effects such as enzyme kind，protease dose，pH，hydrolysis temperature and hydrolysis time on degree of hydrolysis(DH)of squid skin were investigated.The enzyme hydrolysis technology condition was optimized by orthogonal testing.The results showed that the feasible enzyme hydrolysis technology conditions were that the protamex protease dose 14000u/g，pH8.5，hydrolysis temperature 50℃and hydrolysis time 4h，from which the hydrolyzed degree of the squid skin was 20.7%.

squid skin;enzymolysis technology;optimization

TS254.1

A

1002-0306(2011)03-0204-04

近年来，随着我国远洋鱿钓业的迅速发展，鱿鱼日益成为我国主要的海洋经济软体动物和水产品加工原料，仅2005年我国鱿鱼捕获量就达40～50t。目前，我国鱿鱼加工利用技术含量较低，生产中产生的头、内脏、皮等大多都被作为废弃物丢弃、掩埋，不但造成了资源的浪费，而且还污染了环境。因此，如何加工利用这些废弃物，提高渔业的附加值，增加渔民的收入，就成为亟待解决的热点问题。对于水产动物皮的价值以及利用在国内外都已有不少研究报道。无论是在鱼皮制革［1-2］、作为蛋白质新资源［3-7］还是其他生物活性物质提取与利用等［8-10］方面，都显示出水产动物皮的诱人经济价值与前景。鱿鱼皮的胶原蛋白含量较高，约占干重的80%［11］。据报道，胶原多肽的吸收率几乎达100%，且具有抗溃疡、降血压、促进 Ca2+吸收等多种生物学活性［12］。B.Giménez等［6］通过对鱿鱼皮多肽的抗氧化性及其他理化性质的研究，表明其对Fe2+的螯合能力、ABTS自由基的清除能力等有显著的效果。Eresha Mendi等［13］也对秘鲁鱿鱼皮明胶多肽进行了体外抗氧化性的研究，发现其水解物本身就已经显示出了很强的甚至比天然抗氧化剂维生素E还要高很多的脂质抗氧化能力，此外其研究小组还分离出了两种具有强抗氧化能力的小肽并对其序列进行了测定。对于多肽的获取或蛋白质的利用，酶解工艺相对于其它工艺来讲具有简单、安全、经济的特点而被广泛采用。本文以鱿鱼皮为原料，采用酶法水解工艺，对酶进行选择，通过单因素与正交实验确定酶解的适宜条件，以期制取鱿鱼皮多肽，为鱿鱼皮多肽的加工提供理论基础及工艺参数。

2010-03-25 *通讯联系人

林燕(1986-)，女，硕士研究生，研究方向:食品科学。

浙江省科技厅(2009C03017-3);宁波大学科研基金(xkl123)。