张玉然，杨海麟，辛 瑜，仝艳军，张 玲，王 武

(江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122)

分离谷胱甘肽D840树脂的筛选研究

张玉然，杨海麟，辛 瑜，仝艳军，张 玲，王 武*

(江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122)

采用D201、201×7、D354、D840、D001、001×7六种树脂，对从啤酒酵母中抽提的谷胱甘肽超滤样液进行静态吸附比较，筛选出D840树脂的吸附容量最高;并初步研究了树脂的洗脱，在1mL/min的流速下，用0.3mol/L的盐酸洗脱，收集洗脱液中谷胱甘肽，回收率为72.08%，纯度为50.5%。

啤酒酵母，谷胱甘肽，树脂，吸附容量，洗脱

1 材料与方法

1.1 材料与设备

啤酒干酵母 市售;D354、D840、D001、001×7树脂 江苏争光树脂有限公司;D201、201×7树脂江苏苏青水处理有限公司;GSH与GSSG纯品 日本协和(kyowa)发酵株式会社;DTNB试剂 上海世泽生物科技有限公司，SIGMA公司分装;乙腈 江苏汉邦科技有限公司，色谱纯;其它试剂 均为化学分析纯。

Agilent高效液相色谱系统、Agilent氨基酸分析仪 美国安捷伦公司;3K15低温高速离心机 德国SIGMA公司;超滤装置 中科院上海应用物理所膜分离技术研究发展中心;UV754紫外可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;Φ1.0cm×50cm玻璃层析柱 上海锦华层析设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 实验条件 高效液相色谱条件:色谱柱: Agilent C18柱(150mm×4.6mm，5μm);流动相为磷酸盐溶液(取磷酸二氢钾2.72g，庚烷磺酸钠2.02g，加水溶解，定容至 1L，磷酸调节 pH至 2.0)-乙腈(125∶1);流速为0.7mL/min;检测波长为220nm;柱温为25℃，进样量为5μL。

1.2.2 工艺流程

1.2.3 操作要点

1.2.3.1 GSH超滤液的制备 取一定量的啤酒干酵母，按料液比1∶8加入去离子水，混匀，醋酸-盐酸(先加醋酸调pH 3.7，再加盐酸调pH3.5)调至pH 3.5，在69～72℃下，搅拌加热14min，抽提菌液置于冰水浴中冷却至室温离心(6000r/min，12min)，取上清液，采用孔径0.45、0.22μm的混合纤维素酯微孔滤膜进行抽滤。膜压差ΔP=0.25MPa、pH2.0条件下，用含截留分子量5kDa聚醚砜膜的超滤设备进行超滤，黄色澄清滤液用2mol/L的氢氧化钠溶液调节至不同pH备用。

1.2.3.2 GSH超滤液稳定性的研究 取超滤液各25mL，浓盐酸调节pH分别为2.05、4.29、5.97、7.08，放置于层析柜内(25℃)，计时，测定在0、50、90、180min时超滤样液中GSH的浓度。

1.2.3.3 D840树脂的吸附及洗脱 各取28mL pH分别为2.02、2.80、3.59、4.29的GSH超滤液，加入7mL D840湿树脂中，以120r/min的转速在摇床中摇1.5h后(25℃)，测定上清液中GSH的浓度;各取28mL pH 4.29，浓度分别为0.57、1.06、2.18g/L的超滤液，加入7mL D840湿树脂中，以120r/min的转速在摇床中摇1.5h后(25℃)，测定上清液中GSH的浓度;将25mL预处理好的D840湿树脂装入Φ1.0cm×50cm玻璃层析柱中，保证装柱时无气泡产生，树脂上层表面一直有水覆盖，取浓度为2.19g/L、pH 4.27的GSH超滤液，在1.30mL/min的流速下，上样60mL，水洗后，用0.2mol/L的盐酸洗脱，收集洗脱液，测定GSH含量，并使用高效液相色谱法检测洗脱液中GSH纯度。

1.2.3.4 阴离子交换树脂(D201、201×7、D354)的筛选 各取三份60mL pH分别为2.02、2.7、3.51、4.32的GSH超滤液，分别加入10mL D201、201×7、D354湿树脂，25℃下，以120r/min的转速在摇床中摇1.5h后，测定上清液中GSH的浓度。

1.2.3.5 阳离子交换树脂(D001、001×7)的筛选各取两份57mL pH分别为1.05、2.01、2.51、3.02的GSH超滤液，分别加入8mL D001、001×7湿树脂，以120r/min的转速在摇床中摇1.5h后(25℃)，测定上清液中GSH的浓度。

1.2.3.6 D840、001×7、201×7三种树脂的筛选 取60mL pH 4.29的超滤液加入10mL D840和201×7树脂中，另取 60mL pH2.01的超滤液加入 10mL 001×7树脂中，以120r/min的转速在摇床中摇1.5h后(25℃)，测定上清液GSH的浓度。

1.2.4 测定方法

1.2.4.1 GSH的含量测定 改进的Ellman’s测定方法［8］，试管中共16mL反应体系，含有0.8mL DTNB溶液(4mmol/L DTNB，0.1mol/L Na2HPO4)，一定体积的Na2HPO4缓冲液(0.1mol/L，pH6.98)和样品溶液，漩涡混合器混合后，室温静置6min，测定412nm处样液OD值，根据建立的标准曲线计算测定样品中GSH的浓度。

1.2.4.2 蛋白质含量测定 采用Bradford检测法，见参考文献［9］。

1.2.4.3 树脂的预处理及相关数据计算方法 使用去离子水冲洗树脂，除去机械杂质，首先用约2倍树脂体积的饱和食盐水溶液浸泡16～18h，清水漂净，至上清液不带黄褐色;然后用两倍树脂体积的2%～4% NaOH溶液浸泡5～7h，放尽碱液，用水冲洗树脂至中性;最后用两倍树脂体积的4%～6%HCl溶液浸泡6～8h，放尽酸液，用水冲洗树脂至中性，备用。阳离子树脂先用碱溶液处理后用酸溶液处理，阴离子树脂先用酸溶液处理后用碱溶液处理。

料液比=干酵母总量(g)/去离子水体积(mL)

树脂GSH交换容量=树脂吸附上样液中GSH的总量(mg)/所用树脂的总量(mL)

上样液GSH吸附率(%)=(原上样液GSH浓度-树脂吸附后上样液GSH浓度)/原上样液GSH浓度×100%

2 结果与讨论

2.1 GSH超滤液稳定性的研究

离子交换层析时，由于GSH超滤液中具有氧化性物质，不同时间和pH条件下超滤液内GSH氧化率不同，以下测定了不同时间和pH条件下，超滤样液中GSH的浓度，计算GSH氧化率，以下数据均测定三次，结果见图1。

图1 不同时间和pH对超滤液中GSH稳定性的影响

由图1可知，pH越低，超滤液中GSH稳定性越好，在pH2.05、4.29、5.97、7.08时，90min后GSH总氧化率分别为1.40%、3.83%、11.49%、31.02%，因此在对GSH超滤液进行树脂静态吸附时，控制pH越低越好，最佳使用pH应低于4.5左右，以降低GSH氧化损失。

2.2 D840树脂的吸附及洗脱

2.2.1 pH对D840树脂GSH交换容量的影响 上样超滤液的pH是影响树脂GSH吸附的重要因素之一，pH过低将使氢离子浓度过大，影响GSH的吸附，pH过高会导致GSH不同程度的氧化，由于GSH等电点为2.89，因此在pH2.02～4.29范围内对D840树脂GSH交换容量进行测定比较适宜，以下数据均测定三次，结果见图2。

由图2可知，GSH超滤液在pH 4.29时吸附量最大，这是因为在pH4.29时，GSH整体带负电荷，可更强竞争性吸附D840树脂功能基团末端的氨基和亚氨基;而在pH2.02时，由于样液中存在大量的氢离子影响GSH的吸附，因此在pH2.02～4.29范围内，选择pH4.29较为适宜。

图2 pH对D840树脂GSH交换容量的影响

2.2.2 料液浓度对D840树脂GSH交换容量的影响

用同体积不同浓度的超滤液上样将影响树脂GSH交换容量，以下为不同浓度的超滤液中，树脂GSH的交换容量的曲线，以下数据均测定三次，结果见图3。

图3 上样液浓度对D840树脂GSH交换容量的影响

由图3可知，在料液浓度为0.54～2.18g/L时，随着料液浓度的增加，D840树脂GSH交换容量也增大，这将提高树脂的利用率，减小生产成本，对于树脂的最大最适上样浓度后期将进一步研究。

2.2.3 D840树脂的洗脱 D840树脂具有较高的交换容量，以下为在1mL/min流速下，上柱60mL样液，水洗涤去杂后，用0.3mol/L盐酸洗脱的曲线，分组收集，结果见图4。

图4 盐酸洗脱曲线

由图4可知，盐酸洗脱时洗脱峰集中，这是由于用0.3mol/L盐酸洗脱时，树脂内酸性pH将远低于GSH等电点，此时GSH带正电荷易被洗脱，收集洗脱液，进行高效液相色谱分析，图5、图6为洗脱液的高效液相色谱图谱。

由图6可知，GSH已成为洗脱液中的主含量物质，相比于前期超滤液中的微量GSH含量，纯度提高，此洗脱液中GSH回收率为72.08%，纯度约为50.5%，为后期GSH的精提提供良好条件。

图5 GSH纯品的高效液相色谱图谱

图6 GSH洗脱液的高效液相色谱图谱

2.3 阴离子交换树脂(D201、201×7、D354)的筛选

pH是影响树脂GSH吸附的重要因素之一。pH过高会导致GSH不同程度的氧化，由于GSH等电点为2.89，因此对于阴离子交换树脂，在pH2.02～4.29范围内对树脂GSH交换容量进行测定比较适宜，以下数据均测定三次，结果见图7。

图7 不同pH条件下三种阴离子交换树脂交换容量的比较

由图7可知，在pH 2.02～4.32时，201×7型树脂的GSH交换容量优于其它两种树脂，且在pH 4.32时交换容量最大。这是由于大孔阴离子交换树脂不仅可以吸附带负电荷的小分子物质，也可以吸附带负电荷的大分子物质，这将降低GSH的交换容量。

2.4 阳离子交换树脂(D001、001×7)的筛选

pH是影响树脂GSH吸附的重要因素之一，pH过低将使氢离子浓度过大，影响GSH的吸附，由于GSH等电点为2.89，因此对于阳离子交换树脂，在pH 1.05～3.53范围内对树脂GSH交换容量进行测定比较适宜，结果见图8。

图8 不同pH条件下两种树脂交换容量的比较

由图8可知，在pH 1.05～3.53时，001×7型树脂的GSH交换容量优于D001大孔树脂，且在pH为2.01处交换容量最大。这是由于D001大孔树脂不仅可以吸附正电荷小分子物质，还可以吸附带正电荷的大分子物质，会导致GSH交换容量的降低。

2.5 D840、001×7、201×7三种树脂的筛选

以上分类对几种树脂的GSH交换容量进行了比较，以下为每种树脂在最佳pH条件下的交换容量比较，以下数据均测定三次，结果见图9。

图9 三种树脂GSH交换容量的比较

由图9可知，三种树脂在各自最佳的pH条件下，D840树脂吸附量最高，这可能是由于D840功能基团上一个氨基和一个亚氨基，能更多吸附GSH，而其他两种树脂吸附能力较弱，因此选用D840树脂。

3 结论

通过对D201、201×7、D354、D840、D001、001×7六种树脂静态吸附量的比较，D840树脂的静态交换容量最大，后期在1mL/mL流速下，用0.3mol/L盐酸进行初步洗脱研究，得到洗脱液中回收率为72.08%，GSH纯度即可达到约50.5%，此种树脂交换容量大，可提高树脂的利用率，降低成本，初步洗脱得到的洗脱液GSH纯度较高，也为进一步分离得到高纯度GSH产品提供有利条件，后期将进一步优化研究D840树脂的洗脱条件。

［1］Meister A，Anderson M E.Glutathione［J］.Annual Review of Biochemistry，1983，52:711-760.

［2］Izawa S，Inoue Y，Kimura A.Oxidative Stress Respnse in Yeast-Effect of Glutathione on Adaptation to Hydrogen-Peroxide Stress in Saccharomyces Cerevisiae［J］.Febs Letters，1995，368 (1):73-76.

［3］刘振玉.谷胱甘肽的研究与应用［J］.生命的化学，1995，15 (1):19-21.

［4］王辉，冯万祥.含汞树脂分离提纯谷胱甘肽［J］.华东理工大学学报，1996，22(6):717-721.

［5］Maki Haruhiko，Fukuda Hideki.The Separation of Glutathione and Glutamic Acid Using a Simulated Moving-Bed Absorber System［J］.Fermentation Technology，1987，65(1):61-70.

［6］邱雁临，胡静，缪谨枫，等.大孔树脂分离啤酒废酵母中谷胱甘肽的研究［J］.现代食品科技，2008，24(2):131-133.

［7］胡晓梅，黄绢，舒媛，等.离子交换树脂分离纯化谷胱甘肽的研究［J］.发酵科技通讯，2008，37(4):20-22.

［8］Ellman G L.A Calorimetric Method for Determining Low Concentrations of Mercaptans［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics，1958，74(2):443-450.

［9］Bradford M，Marion M.A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quangtities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding［J］.Analytical Biochemistry，1976，72:248-254.

Study on screening of D840 resin used to separate glutathione

ZHANG Yu-ran，YANG Hai-lin，XIN Yu，TONG Yan-jun，ZHANG Ling，WANG Wu*
(Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

Six exchange resins including D201，201×7，D354，D840，D001 and 001×7 were used for separating glutathione from the ultra-filtration solutions extracted from beer yeasts.D840 resin had relatively high capacity. Under the condition of stated elution rate(1mL/min)，the recovery of GSH was 72.08%eluting by hydrochloric acid (0.3mol/L)，and the purity of GSH was 50.5%.

beer yeasts;glutathione;resin;adsorption capacity;elute

TS201.1

A

1002-0306(2011)03-0146-04

谷胱甘肽(GSH)是一种具有重要生理功能的天然活性三肽(L-γ-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸)［1］，具有抗氧化、解毒、改善风味等作用，在临床医药、食品行业以及化妆品行业等领域有着广泛的用途［2］，在空气中易氧化成氧化性谷胱甘肽(GSSG)，近期研究发现GSH还具有抑制艾滋病的作用［3］。GSH的生产方法主要有萃取法、化学合成法、发酵法，其中以发酵法为主。从发酵液中分离提取GSH的方法有铜盐法、金属螯合亲和色谱法［4］、离子交换树脂分离法［5］，其中铜盐法是一种比较传统的方法，工艺复杂，污染较大，残留的铜离子也影响GSH的应用范围;金属螯合亲和色谱法，一般需要使用含重金属的树脂，此类树脂对酸碱敏感，稳定性差，GSH产品重金属含量易超标;离子交换树脂工业近几年在我国发展迅速，具有树脂可重复利用、价格低廉、分离快速、易于工业化等优点，正在成为后期GSH分离的热门技术。近年来我国也有一些关于用离子交换树脂分离谷胱甘肽的报道［6-7］，但使用树脂的种类较为单一，很少有对多种树脂进行综合筛选的报道。本工作对一种螯合树脂(D840)、三种阴离子交换树脂(D201、201×7、D354)和两种阳离子交换树脂(D001、001×7)进行比较，确定D840树脂交换容量最高，并对树脂的洗脱进行了初步研究。

2009-12-25 *通讯联系人

张玉然(1985-)，女，在读硕士，研究方向:生物化学与分子生物。

江南大学自主科研计划学科交叉创新团队基金(1042050205091140)。