王小梅，孙润广，薛慧君，韩 涛

(陕西师范大学物理学与信息技术学院生物物理与生物医学工程实验室，陕西西安710062)

麦冬多糖POJ-U1A的结构研究及原子力显微镜观测

王小梅，孙润广*，薛慧君，韩 涛

(陕西师范大学物理学与信息技术学院生物物理与生物医学工程实验室，陕西西安710062)

用功率超声从麦冬中提取麦冬多糖POJ-U1，通过DEAE-52 cellulose色谱柱和Sephadex G-150凝胶色谱柱进行分离纯化得到POJ-U1a，采用高效凝胶渗透色谱法测定其分子量，采用红外光谱法、气相色谱法对其化学结构进行研究，原子力显微镜观察其微观形貌。结果表明，麦冬多糖POJ-U1a的平均分子量为4.02×103D，是一种由均一葡萄糖组成的葡聚糖，具有糖类物质的特征吸收峰，同时存在呋喃环，是具有高度分枝的化学结构的多糖。

麦冬多糖，结构分析，原子力显微镜(AFM)

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

麦冬 浙江产;95%乙醇、苯酚、浓硫酸、氯化钠均为分析纯;DEAE-52 Whatman;Sephadex G-150 Pharmacia。

KQ3200B型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;JY92-Ⅱ型超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技有限公司;TU-1810紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司;CF16RX高速离心机 日本日立公司;系列层析柱2.5×60cm 上海琪特分析仪器有限公司;TB-215D电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司，精度:1/105g;FD-1A真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器公司; Waters1525高效液相色谱仪，Waters2414示差折光检测器，Trace-2000高效气相色谱仪，日本岛津SPM-9500J3原子力显微镜，Avatar360E.S.P.F TIR傅里叶变换红外光谱仪(尼高力)。

1.2 实验方法

1.2.1 麦冬多糖的提取 将麦冬块根60℃烘干后粉碎，加入4倍体积的95%乙醇超声脱脂三次，烘干，取80g脱脂后的块根粉末，按料液比1∶10加蒸馏水，搅拌使其充分溶解，置于超声波细胞粉碎机下提取，提取条件:超声时间10s，间隙时间15s，超声次数90次，超声功率80W，提取两次，两次的提取液经减压浓缩，用四倍量95%乙醇醇析得粗多糖沉淀，离心，透析，真空冷冻干燥后得麦冬粗多糖POJ-U1。

1.2.2 麦冬多糖的分离纯化［6-7］

1.2.2.1 DEAE-52 cellulose色谱柱层析 将麦冬多糖1.0g溶于12mL蒸馏水，12000r/min，4℃，离心20min，上DEAE-52 cellulose色谱柱，梯度洗脱法洗脱各级分，洗脱液分别为蒸馏水、0.05mol/L NaCl溶液、0.3mol/L NaCl溶液，流速为6s一滴，20min一管，全自动部分收集器收集洗脱液，苯酚-硫酸法在487nm波长下比色检测糖含量。以试管数目为横坐标，吸光度值为纵坐标，作DEAE-52 cellulose色谱柱洗脱曲线图。合并各主峰溶液，浓缩，流水透析，冷冻干燥，得POJ-U1a、POJ-U1b、POJ-U1c。

1.2.2.2 Sephadex G-150凝胶色谱柱层析 将之前收集的最多的组分进行凝胶色谱分离。流速为4s一滴，10min收集一管，苯酚-硫酸法检测。以试管数目为横坐标，吸光度值为纵坐标，作DEAE-52 cellulose色谱柱洗脱曲线图。合并各主峰溶液，浓缩，蒸馏水透析，冷冻干燥，得POJ-U1a。

1.2.3 高效液相色谱法测定多糖分子量［8-9］色谱条件:色谱柱:Shodex Ohpak SB-804 HQ;流动相:高纯水;流速:0.8mL/min;柱温:30℃;检测器:示差折光检测器;进样量:20μL。

标准曲线的制作:用系列标准葡聚糖作为分子量标准品，用流动相溶解制成2mg/mL溶液分别进样，记录洗脱峰的保留时间，以标准分子量的对数值为纵坐标，以相应谱峰的保留时间为横坐标进行线性回归，得线性回归方程为:lgMw=-0.6638x+ 10.113(R2=0.9997)，其中:x为保留时间;Mw为平均分子量。

多糖分子量的测定:将多糖样品溶于高纯水制成2mg/mL溶液，在相同色谱条件下进样分析，记录保留时间，带入回归方程算得平均分子量。

1.2.4 傅里叶红外光谱测定［10］称取 POJ-U1a 1mg，加入 100mg KBr充分研磨，压片，在 4000～600cm-1波长范围内用红外光谱仪进行扫描。

1.2.5 气相色谱分析［11］称取5mg POJ-U1a样品，加入2mol/L的三氟乙酸3mL，110℃下水解6h，取出，加入少量甲醇，于旋转蒸发仪50℃减压浓缩，重复三次，以除尽三氟乙酸，得水解产物。水解产物加入0.5mL无水吡啶，10mg盐酸羟胺，2mg肌醇六乙酰酯(内标)，于恒温水浴锅中90℃反应30min，取出，冷却至室温。然后加入0.5mL无水乙酸酐90℃下继续反应30min进行糖腈乙酰化，气相色谱分析。

气相色谱条件:OV-17毛细管柱;FID检测器;升温程序:150℃(7℃/min)→190℃(15℃/min)→250℃;进样口温度280℃;检测器温度260℃;Air∶H2∶N2= 300∶30∶30，载气流速10mL/min;进样量1μL。

1.2.6 原子力显微镜研究［12-14］将麦冬多糖 POJU1a配成浓度为2.5μg/mL的溶液，磁力搅拌器搅拌4h，用移液器取5μL滴在新剥离的云母表面，自然风干，置于原子力显微镜下进行扫描观测。测试在室温下进行，湿度为50%～60%，探针为Si3N4，微悬臂长200μm，微悬臂的弹性常数为0.28N/m。

2 结果与分析

2.1 麦冬多糖POJ-U1a的紫外吸收光谱扫描及蛋白质检测结果

麦冬多糖POJ-U1a的水溶液在190～400nm处进行全波长扫描，结果在191nm处有多糖特征吸收峰。在260～280nm范围内无吸收峰，表明麦冬多糖POJ-U1a中不含有蛋白质和核酸。

2.2 DEAE-52 cellulose色谱柱层析结果

由图1可以看出，实验中检测到的麦冬多糖共有三种组分，用蒸馏水、0.05mol/L NaCl、0.3mol/L NaCl溶液洗脱均出现一个峰，依次命名为POJ-U1a、POJ-U1b和POJ-U1c，其中POJ-U1a多糖含量最高，因此将其峰位合并，冷冻干燥，为下一步纯化备用。

图1 麦冬多糖DEAE-52纤维素柱层析图

2.3 Sephadex G-150凝胶色谱柱层析结果

由图2可以看出，POJ-U1a经Sephadex G-150凝胶色谱柱层析，流出曲线为单一对称峰，表明POJ-U1a为分子量分布均一的麦冬多糖组分。

2.4 麦冬多糖POJ-U1a的分子量测定

如图3所示，麦冬多糖POJ-U1a经高效液相色谱得到的峰形为单一对称峰，表明其为均一多糖，由标准曲线求出其平均分子量为4.02×103D。

2.5 红外光谱分析

如图4所示，麦冬多糖POJ-U1a的特征吸收峰: 3423cm-1出现的宽峰是O-H伸缩振动峰，表明该多糖存在分子间和分子内氢键;2926cm-1和2853cm-1处为多糖-CH2-的C-H伸缩振动引起的;1637cm-1处为多糖中结晶水或氨基N-H变角振动引起的; 1119cm-1处为多糖C-O伸缩振动引起的;871cm-1处的吸收峰为呋喃环或羟基呋喃环，表明麦冬多糖POJ-U1a中的糖环构型为呋喃类。

图2 POJ-U1a的Sephadex G-150凝胶层析柱色谱图

图3 麦冬多糖POJ-U1a的高效液相凝胶渗透色谱图

图4 POJ-U1a的红外光谱图

2.6 气相色谱分析

气相分析图5和图6表明，麦冬多糖POJ-U1a由单一葡萄糖组成，属于葡聚糖。

图5 混合标准单糖气相色谱图

2.7 原子力显微镜观测结果

原子力显微镜(AFM)是以物理学原理为基础的一种新型表面分析仪器，能够提供生物大分子纳米级的三维结构信息，因此被广泛应用于高分子聚合物和生物大分子表面形貌的研究［15］。

图6 POJ-U1a衍生物的气相色谱图

如图7(A、B)可以看到，麦冬多糖POJ-U1a由长链折叠、缠绕形成，分枝较多，图像的对比度依赖于针尖上的作用力大小，作用力太大易损坏糖链，太小对比度较差，图像模糊，最佳的作用力为3～4nN，从图中可以看到，多糖聚合物链相互缠绕，链的高度均在1nm左右，链宽0.2～0.7μm，一般多糖的分子链大小为0.1～1.0nm，我们得到的图像宽度远大于单链分子的估计值，这一方面可能是由于针尖在扫描时与分子间相互作用导致增宽效应;另一方面估计是由于糖链间范德瓦尔斯力相互作用及糖链与带负电的云母表面产生相互作用，使得多糖链分子聚集平铺在云母表面。链间通过糖单元间不同的连接方式衍生出许多大大小小的环状结构，尺寸在几百纳米到几个微米不等，证明麦冬多糖大分子具有高度分枝的化学结构。

图7 POJ-U1a的AFM图像

由图7(C)可以清楚地看到，链中有孔洞出现，图7(D)可以看出，这些孔洞的形成是链间相互缠绕、折叠的结果。还可以看到多糖分子间的缠绕及螺旋状排列，此螺旋结构再相互聚集，形成比较大的多糖聚集体，这种现象可能是Van Der Waals相互作用及链间氢键缔合所导致的。

总之，利用功率超声从麦冬中提取麦冬多糖是一种简单、可行而有效的方法。应用层析柱法对麦冬粗多糖进行分离纯化，可以得到纯度比较高的单一组分。高效液相色谱法、红外光谱法、气相色谱法及原子力显微镜也是分析麦冬多糖结构的有力手段。

3 结论

用高效液相色谱、气相色谱、傅里叶红外光谱对超声提取麦冬多糖的结构进行分析，结果表明，麦冬多糖POJ-U1a为均一多糖，其平均分子量为4.02× 103D;麦冬多糖POJ-U1a具有一般多糖类物质的特征吸收峰，它的单糖残基以呋喃环的形式存在;麦冬多糖POJ-U1a为葡聚糖，极易溶于水，黏度非常高，估计是麦冬中黏性物质的主要成分。用原子力显微镜观察麦冬多糖POJ-U1a，结果得到了清晰、稳定的图像，证明麦冬多糖具有高度分枝的化学结构。

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Structure investigation and observation of microstructure of ophiopogon japonicus polysaccharide POJ-U1a with atomic force microscope

WANG Xiao-mei，SUN Run-guang*，XUE Hui-jun，HAN Tao
(College of Physics and Information Technology，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China)

Ophiopogon japonicus polysaccharide JOP-U1 was extracted by ultrasonic power.It was separated and purified by DEAE-52 cellulose column and Sephadex G-150 gel column，POJ-U1a was acquired，then its relative molecular weight was determined by high performance gel permeation chromatography(HPGPC)，its chemical structure was analyzed by the techniques of infrared spectrometry and gas chromatography，and its external figure was observed by atomic force microscopy(AFM).The determination results showed that the relative molecular weight of ophiopogon japonicus polysaccharide POJ-U1a was 4.02×103D，it is glucan composed by glucose.The infrared spectrum suggested that there were characteristic absorption bands of polysaccharide in JOP-U1，and its monosaccharide residues existed in the forms of furan rings.AFM revealed that it had a multi-branched structure in linkages of adjacent monosaccharides.

ophiopogon japonicus polysaccharide;structure analysis;atomic force microscopy(AFM)

TS201.2+3

A

1002-0306(2011)03-0081-04

麦冬为百合科多年生草本植物的干燥块根，主要活性成分麦冬多糖具有多种生物活性，主要表现在抗心肌缺血、降血糖、耐缺氧能力、抗过敏活性、免疫活性、对胃肠道作用活性等方面［1-2］。为了提高中药生产效率，已有不少研究者将功率超声技术引用到中药提取过程中，研究超声作用对中药提取过程的影响，并取得了一定的成果。如G.L.Cote等［3］对不同频率超声波的降解作用进行了研究，发现20kHz的超声波比1.5MHz超声波的降解作用更强，使得所得产品具有非常低的分子量分布。Mei Zhang等［4］运用热水法和超声波处理法分别对侧耳菌核和菌丝体进行提取，结果表明，侧耳菌核和菌丝体中水溶性多糖的抗肿瘤活性依赖于其分离方法，不同的分离方法对提取物的分子量和组成成分都会产生一定的影响。目前对于超声提取麦冬多糖的分离纯化及结构的研究尚不多见，超声提取对麦冬多糖结构的影响是一个值得研究的问题。由于多糖结构复杂，且难以形成晶体，因此对其结构的研究比较困难，原子力显微镜的出现使得多糖表面形貌的观察成为可能［5］。本实验通过功率超声提取麦冬多糖，并对其进行分离纯化，利用原子力显微镜观察其微观形貌，获得了较清晰的分子链构象，这为进一步研究其微观结构提供了重要的实验依据。

2009-09-07 *通讯联系人

王小梅(1983-)，女，硕士研究生，主要从事分子生物物理研究。

国家自然科学基金(10874108);陕西省自然科学基础研究计划(SJ08A16)资助。