何建伟,李 静,赵 涛,曹薇薇

(1.石河子大学医学院第一附属医院检验科,新疆石河子832002;2.新疆农九师额敏县医院神经内科;3.石河子大学医学院2008级检验本科班;4.石河子大学医学院民族高发病重点实验室)

抗核抗体(antinuclear antibody,ANA)主要用于自身免疫性疾病的筛查,而可提取性核抗原(extracted nuclear antigen antibody,ENA)抗体谱对于自身免疫性疾病的诊断、鉴别诊断及临床治疗有重要的帮助[1]。本研究是对本科室开展的1084例ANA检测结果和512例联合检测ANA、抗ENA抗体谱的结果进行回顾性分析,探讨ANA荧光核型与抗ENA抗体不同项目阳性结果之间的相关性,现将结果报告如下:

1 资料与方法

1.1 标本来源 自2009年6月至2011年4月在新疆石河子大学第一附属医院就诊的门诊和住院病人,患者来自于新疆石河子地区包括市区及周边农牧团场等汉族人群1 084例,均用非抗凝管真空采静脉血分离血清。男女性别比是1∶3.27。年龄10-85岁,平均年龄46.9±17.9岁。

1.2 试剂与方法

1.2.1 试剂 间接免疫荧光法检测ANA,FITC标记的IgG型鼠抗人抗体(Dako Denmark A/S)。抗ENA抗体检测试剂盒购自德国欧蒙公司。试剂均在有效期内使用。

1.2.2 方法

①间接免疫荧光法检测ANA 将血清与配置好的缓冲液进行1∶100倍稀释,取25 μ l血清与鼠肝组织印片室温反应30 min,冲洗反应液后,缓冲液浸泡5 min后加荧光二抗,室温反应30 min,在重复洗涤浸泡,甘油封片,在荧光显微镜下阅片。

②抗ENA抗体谱的检测:每槽加入1 ml孵育液后加入待检血清10 μ l,37℃振荡孵育30 min后,稀释液洗涤3次,每槽加入酶标二抗1 ml,37℃振摇孵育30min,再同上洗涤,之后加入显色底物1 ml振摇10 min,最后加入终止液1 ml终止反应,1 min后弃去液体结果判定。

1.3 仪器 间接免疫荧光法检测ANA采用Olympus IX71型荧光显微镜(日本生产)观察荧光核型。抗ENA抗体谱检测采用BY-80S脱色摇床(金坛市恒丰仪器厂)振摇。

1.4 结果判定标准

1.4.1 间接免疫荧光法检测ANA判定标准 荧光显微镜下观察鼠肝细胞荧光染色情况。无特异性荧光判为为阴性,产生明显特异性荧光染色并可辨荧光模型则可判为阳性。阳性血清按1∶20、1∶40、1∶80、1∶160......滴度系统测得抗体最终滴度,滴度≥1∶40记为阳性,同时报告荧光核型。ANA核型分类为核匀质型,核斑点型、核周型和混合型(为便于分析,把前三种荧光核型以外的所有荧光核型归为混合型)。

1.4.2 抗ENA抗体谱结果判定标准 反应后的膜条与标准谱带图对照,相应的谱带定位和带型出现着色后,可判定相应抗体阳性。ENA抗体检测项目中有1项以上阳性时,就记为抗ENA抗体阳性。

1.5 统计学处理 采用SPSS 11.0软件对结果进行统计分析。ANA结果和抗ENA抗体结果的一致性用Kappa值计算分析。不同核型ANA标本中抗ENA抗体阳性率比较通过统计学计算得到。抗ENA抗体中各项目与各种荧光核型的关系比较采用 χ2检验 。

2 结果

2.1 ANA阳性标本与抗ENA抗体阳性标本吻合程度分析(见表1)

表1 ANA阳性标本与抗ENA抗体阳性标本吻合程度分析

本研究1084份样本中仅512份样本联合检测ANA和抗ENA抗体。Kappa值=0.249,说明吻合程度很差。

2.2 ANA阳性标本的核型分析

512份临床标本联合检测ANA抗体和抗ENA抗体。ANA阳性标本数为169例。其核型分布见表2。核型阳性构成比例最高的是核均质型72.18%(122/169),其次是核斑点型18.34%(31/169)、核周型7.10%(12/169)、混合型2.37%(4/169)。

表2 不同核型ANA标本中抗ENA抗体阳性率比较

2.3 不同核型ANA标本中抗ENA抗体阳性率比较 见表2。

2.4 169例ANA阳性标本中抗ENA抗体与各种荧光核型之间的相关性分析(见表3)。

抗ds-DNA抗体在核周型ANA标本中的阳性率最高(χ2=24.095,P＜0.01),说明抗ds-DNA抗体主要与核周型荧光核型相关。抗Ro/SSA60抗体单项阳性总例数最多,达到56例(33.1%),其核型分布比较分散,但主要表现为核均质型与核斑点型,阳性率差异有统计学意义 (χ2=38.637,P＜0.05)。抗 Ro/SSA52、抗 La/SSB抗体基本上与抗R0/SSA60抗体同时出现。在各种核型ANA标本中的阳性率有差异(χ2=13.714,P＜0.02)。抗ulRNP抗体在斑点型ANA标本中的阳性率最高,均质型次之,差异有统计学意义(χ2=23.978,P＜0.05)。抗Ribosomal抗体在核周型ANA标本中的阳性率最高(41.7%),差异有统计学意义(χ2=22.502,P＜0.05)。Sm抗体在斑点型ANA标本中的阳性率最高(29%),在各种荧光核型中的阳性率差异也有统计学意义(χ2=28.993,P＜0.05),且抗Sm抗体主要与抗u1RNP抗体同时出现。抗组蛋白抗体在核周型ANA标本中的阳性率最高(41.7%),在各种ANA荧光核型中的表达差异有统计学意义(χ2=20.610,P＜0.05),抗Jo-1抗体、抗Scl-70抗体抗着丝点抗体和抗P0抗体检出例数较少,在各种荧光核型中的阳性率差异无统计学意义(P＞0.05)。

表3 抗ENA抗体与各种荧光核型的结果分析

3 讨论

本研究共1084份样本检测了ANA抗体,其中399例ANA抗体阳性,即:在怀疑自身免疫性疾病患者中的ANA阳性率36.81%(399/1084),稍低于文献报道的39.9%[2]。这一结果提示新疆石河子地区ANA阳性率与其他地区有不同。

本研究1084份样本中仅512份样本联合检测ANA抗体和抗ENA抗体,两种检测方法吻合度Kappa值为0.249。表明:这两种检测方法的吻合程度不好(Kappa＜0.7)。值得注意的是:有343例ANA阴性的血清标本中出现80例抗ENA抗体阳性,假阴性率为 23.3%(80/343),原因可能与本实验室检测ANA抗体的方法学有关。2009年2月美国风湿病协会声明 :间接免疫荧光法是检测ANA的金标准,使用的是喉癌上皮细胞(Hep-2细胞),此细胞包含有100-150种自身抗原,这种方法既能检测出细胞核型也能够检测出相应核型的滴度,并且能够检测出其它检测方法所不能检测出的自身抗原。而本实验室因检测成本原因采用鼠肝印片检测ANA抗体,虽然能基本满足ANA检测要求,但很可能导致部分ANA抗体阳性标本漏检。故建议应参照[3]NCCLS的关于IIF ANA检测的质量保证操作指南并加以实施,同时参加室间质评以提高ANA检测结果的正确性。另外,169例ANA抗体阳性的标本中88例抗ENA抗体阴性,提示用抗ENA抗体检测试剂盒未能检测出某些自身抗体。因此,有必要进一步纯化多种生化性质明确的抗原,并且进一步研究新的自身抗原,扩展抗ENA抗体谱,以提高抗体的检出率。2009年一种新的自身抗原HnRNP H1[4]被发现,相信在不久的将来会发现更多的诊断指标并应用于临床,为自身免疫性疾病的早期诊断与及时治疗提供有力的帮助。各型ANA标本中抗ENA抗体阳性率比较结果(见表2),表明:混合型ANA标本中抗ENA抗体阳性率最高:75%(3/4)。核斑点型次之:64.5%(20/31),核周型阳性率为58.3%(7/12),核均质型阳性率达41.8%(51/122),各型阳性率差异有显著性(χ2=37.997,P=0.000)。有文献报道[5]:各型ANA标本中抗ENA抗体阳性率最高的是斑点型(53.8%),其次是均质型(49.4%)、核周型(16.7%)、混合型(28.9%)。结果表明:本地区的汉族人群的ANA标本中抗ENA抗体阳性率有自身特点。

本实验结果反映不同荧光核型的ANA与抗ENA抗体之间的关系有各自的特点见表3。169例ANA阳性标本中72.18%是核均质型,主要与抗R0/SSA 60有关。而车友英[2]等报道有所不同:核均质型与 dsDNA、Histone和/或核小体抗体阳性有关。ANA阳性标本中18.3%是斑点型ANA,主要与抗R0/SSA 60、抗U1RNP、抗Sm抗体相关,与魏方等[7]报道一致。核周型ANA仅仅12例,核周型ANA与抗R0/SSA60、抗dsDNA、抗核小体抗体、抗组蛋白抗体等均相关。抗Scl-70抗体本文统计的阳性率低,仅为4.1%,见于均质型ANA。与魏方[6]的文献报道的不一致,其原因可能是抗 ENA抗体试剂盒对抗Scl-70抗体的敏感性低有关。抗Jo-1抗体仅1例阳性,为核均质型,在今后的工作中必须对抗Scl-70抗体和抗Jo-1抗体检测引起足够的重视。由以上分析可知:虽然ANA与抗ENA抗体之间有一定的关系,例如:核均质型ANA主要与R0/SSA有关,斑点型ANA主要与抗U1RNP、抗Sm抗体相关。但 dsDNA抗体和抗Scl-70抗体与多种ANA核型有关,且各地报道也不一致。因此,一种自身抗体可以出现不同的荧光染色核型,不同的自身抗体可以出现相同的荧光核型,ANA的荧光核型与抗ENA抗体类型没有绝对的规律可寻。必须用间接免疫荧光法筛查ANA,并联合检测抗ENA抗体谱,才能基本上确定ANA靶抗原的具体类型,从而体现出对自身免疫性疾病的诊断与鉴别诊断的价值。

[1]王兰兰.自身抗体检测的应用与质量保障原则[J].中华检验医学杂志,2005,28(10):987.

[2]车友英,谭延国,韦希明.312例抗核抗体与抗细胞核细胞浆抗体谱检测结果的分析[J].中国实验诊断学,2008,12(8):1031.

[3]National Committee for Clin ical Laboratory S tandards.Quality assurance for the indrect immunoflurore test for autoantibodies to nuclear antigen(IF ANA):approved guidelin[J].NCCLS,1996.

[4]VandenBergh K,Hooijkaas H,Blockmans D,et al.Heterogeneous nuclear ribonucleo protein h1,a novel nuclear autoantigen[J].Clin Chem,2009,55(5):946.

[5]李霞,梅冰,王昌富.979例自身免疫性疾病抗核抗体与抗ENA抗体联合检测的结果分析[J].分子诊断与治疗志,2009,1(3):175.

[6]魏 方.抗核抗体与抗ENA抗体的相关性分析[J].实验与检验医学,2009,27(1):61.