刘声茂,崔英春,田向辉,顾 华,吴 曼,刘庆鑫,张冬梅*

(1.吉林大学第二医院肾病内科,吉林长春130041;2.吉林大学中日联谊医院肾病科)

胰淀素(amylin)是胰岛β细胞分泌的一种由37个氨基酸残基组成的神经肽样分子,是近年来被确认的一种具有生理活性的胰岛激素。有学者报道[1],约70%-90%的2型糖尿病患者存在胰岛淀粉样变性,其沉积物的主要成分为amylin。糖尿病肾病(DN)患者存在amylin表达、分泌异常,导致其外周血中amylin水平增高,并在肾脏沉积引起肾损伤[2]。其致病机制为DN患者体内胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)所致的高胰岛素血症和高amylin血症,可以导致amylin在肾小球沉积,成为肾小球结节样病变的病因之一,此外,amylin还可以诱导系膜细胞凋亡加重局部组织损伤和纤维化的形成。肥胖相关性肾病(Obesity-related glomerulopathy,ORG)也伴有IR,也会出现高胰岛素血症和高amylin血症,是否可以导致amylin在肾小球的沉积,诱发肾脏损伤,目前尚未见这方面的报道。本实验采用临床观察结合动物实验的方法,旨在探讨amylin在ORG进展中作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

人血清Amylin-ELISA试剂盒及大鼠Amylin-ELISA试剂盒(上海恒远生物科技有限公司);兔抗人Amylin单克隆抗体、兔抗大鼠Amylin单克隆抗体、生物素化羊抗兔IgG及免疫组化试剂盒(Sigma公司);注射用大鼠Amylin(Sigma公司)。

1.2 临床观察对象及分组

结合临床,经肾穿刺活检肾脏病理明确诊断为ORG的患者为观察组(ORG组,14例),随机选取肾穿刺活检病理明确诊断为系膜增生性肾小球肾炎的患者为对照组(NC组,14例)。所有患者24小时尿蛋白定量＜2.0 g,血肌酐＜200 μ mol/L,均无心 、肝 、肾等疾病史及糖尿病家族史,无急慢性感染及其他自身免疫性疾病,空腹及餐后2小时血糖正常。

1.3 动物实验模型制作及分组

成年雄性Wistar大鼠30只,体重为(200±20)g,适应性喂养3天,随机分为3组:正常对照组(NC组,n=10)、肥胖相关性肾病组(ORG组,n=10)和amylin皮下注射组(Amylin组,n=10)。根据文献建立ORG大鼠模型[3],ORG组和Amylin组大鼠给予高脂饲料(脂肪49%,蛋白21%,碳水化合物30%,盐2%;其中普通饲料59%,熟猪油20%,鸡蛋黄10%,蔗糖9.5%和食盐1.5%,热卡21 kJ/g),NC组给予普通饲料,自由摄食,自由饮水。ORG组和Amylin组大鼠在饲养2个月后用尿蛋白试纸检测尿蛋白,出现尿蛋白即为ORG模型成功。ORG模型成功后,Amylin组大鼠给予大鼠amylin皮下注射(100 μ g/kg)[4],隔日1次,持续2个月。NC组和ORG 组大鼠给予同等剂量的生理盐水皮下注射。

1.4 标本采集

1.4.1 临床标本采集 全部研究对象均抽取非抗凝的静脉血4 ml,留取血清;抗凝血4 ml留取血浆;调取两组患者肾脏病理标本蜡块,制成免疫组化所需标本切片备用。

1.4.2 动物实验标本采集 6个月时各组大鼠用代谢笼留取24 h尿,检测24 h尿蛋白定量。乙醚麻醉下称体重,测量体长即鼻至肛门的长度。心脏取血,3 000 rpm离心10min,分离血清,-70℃保存。迅速开腹取出左肾,去掉被膜,经肾门冠状面取肾组织,置于新配制的10%中性缓冲甲醛液固定,用于光镜观察及免疫组化检测。

1.5 各项指标的检测

1.5.1 患者及大鼠24 h尿蛋白定量(24 h-PRO)检测:考斯亮蓝方法检测。

1.5.2 患者及大鼠血清学指标检测 采用ELISA法检测血清amylin水平;放射免疫法检测胰岛素水平;自动生化分析仪测定血糖(SG)、血脂(TG,TC)。1.5.3 患者及大鼠胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)计算:空腹血糖×空腹胰岛素含量/22.5。

1.5.4 患者及大鼠免疫组化ABC法检测 肾组织切片3 μ m,常规脱蜡至水,加入兔抗大鼠amylin单克隆抗体/兔抗人amylin单克隆抗体(1∶100稀释),再加入生物素化的羊抗兔IgG(1∶100稀释),DAB显色,苏木素复染细胞核,封片观察。

1.5.5 大鼠Lee's指数的计算 Lee's指数=[体重(g)]1/3×103/体长(cm)。

1.6 统计学分析

用SPSS14.0统计软件进行分析,数据以均数±标准差(±s)表示。两组以上比较采用one way ANOVA检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床观察结果

2.1.1 两组患者SG、TC、TG、HOMA-IR及amylin血清含量 与NC组比较,ORG组患者的SG增高,差异无显著性,TC、TG、HOMA-IR及amylin水平均明显增高,差异具有显著性(P＜0.01)。见表1。

表1 两组患者SG、TC、TG、HOMA-IR及amylin血清含量(±s)

表1 两组患者SG、TC、TG、HOMA-IR及amylin血清含量(±s)

▲▲P＜0.01 vs NC组

n SG(mmol/L) TG(mmol/L) TC(mmol/L) HOMA-IR Amylin(ng/L)NC 组 14 4.96±0.41 1.03±0.30 3.92±0.61 2.63±0.69 381.27±99.14 ORG组 14 5.19±0.65 2.40±0.67▲▲ 5.58±0.94▲▲ 7.95±2.77▲▲ 498.98±105.44▲▲

2.1.2 两组患者肾脏amylin表达情况 NC组患者肾小球内无明显amylin表达;ORG组患者肾小球内扩张的系膜区可见阳性表达。见图1。

2.2 动物实验结果

2.2.1 各组大鼠一般状态 第1个月内ORG组和Amylin组大鼠进食量减少,饮水明显增加,行动迟缓,活动量减少;1个半月后ORG组和Amylin组大鼠上述情况均好转;6个月时ORG组和Amylin组大鼠饮水和尿量均明显增多,毛发光亮度减退,活动减少,精神出现不同程度的萎靡。NC组大鼠均正常。

2.2.2 大鼠Lee's指数 分组时各组大鼠Lee's指数比较无统计学差异,6个月实验结束时,ORG组和Amylin组Lee's指数显著高于NC组(P＜0.01),ORG组和Amylin组两组间无显著差异(P＞0.05),见表2。

图1 两组患者肾脏amylin表达,ABC法,400×,A为NC组,B为ORG组

2.2.3 各组大鼠SG 、TC 、TG 、HOMA-IR、amylin 水平及24小时尿蛋白定量的变化 与NC组比较,ORG组和Amylin组大鼠的SG、TG、TC、HOMA-IR 和24 h-PRO均增高,其中ORG组的TC和24h-PRO差异具有显著性(P＜0.05),Amylin组除SG外,其余各指标差异均具有显著性(P＜0.01),但两组SG虽升高,均在正常范围内且差异无显著性;与ORG组比较,Amylin组除SG和HOMA-IR外,其余各指标差异均具有显著性(P＜0.01)。见表3。

表2 各组大鼠Lee's指数值

表3 各组大鼠血糖、血脂、胰岛素抵抗指数、胰淀素水平及24小时尿蛋白定量的变化(±s)

表3 各组大鼠血糖、血脂、胰岛素抵抗指数、胰淀素水平及24小时尿蛋白定量的变化(±s)

▲P＜0.05 vs NC组,▲▲P＜0.01 vs NC组,**P＜0.01 vs ORG组

SG(mmol/L) TG(mmol/L) TC(mmol/L) HOMA-IR Amylin(ng/L) 24 h-PRO(g/24 h)NC组 6.38±3.63 1.60±0.30 0.43±0.18 6.80±4.05 231.77±11.69 0.35±0.09 ORG组 7.75±1.80 1.74±0.19 1.30±0.25▲ 9.36±1.09 232.10±12.59 1.43±0.02▲Amylin组 9.57±2.64 5.83±0.32▲▲**5.37±0.19▲▲**11.93±3.70▲▲ 254.34±31.96▲▲** 1.91±0.45▲▲**

3 讨论

胰淀素是胰岛β细胞分泌的一种由37个氨基酸残基组成的神经肽样分子,与胰岛素(Ins)共同存在于胰岛细胞分泌囊泡中,生理状态下胰淀素参与体内代谢,与胰岛素拮抗来维持人体的正常功能,而人体内胰淀素分泌异常将导致代谢紊乱,出现IR。与此同时,代谢的紊乱又进一步导致胰淀素的异常分泌。因此,胰淀素与IR是互为因果的。当amylin表达、分泌异常时,形成胰岛淀粉样蛋白,沉积在胰岛细胞内及其周围,对胰岛β细胞有细胞毒性作用,使胰岛β细胞团及胰岛素分泌减少,导致β细胞功能障碍和部分胰岛β细胞的丧失,从而导致胰岛β细胞功能进行性衰退[5],并且还诱发及加重IR[6];促进脂肪分解,增加血游离脂肪酸水平[7];活化肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)[8]和活化糖基化终末产物受体,刺激炎症反应发生[7,8],进而参与糖尿病相关并发症的发生。现已经有研究证实,amylin参与糖尿病及DN的发生发展,结果[9]显示DN患者肾组织中有amylin沉积,并主要沉积在肾小球系膜区、K-W结节、增厚的球囊壁和病变的血管壁,肾组织amylin的沉积可能参与了DN患者的肾损伤。而ORG与糖尿病及DN有相似的发病机制及遗传背景,故我们有针对性的选择经临床及病理明确诊断为ORG的患者进行观察,免疫组化染色观察后发现,在ORG患者肾脏亦有表达,为进一步确定amylin在ORG发生发展中的作用是否与参与DN的机制相同,我们采用ORG模型大鼠给予皮下注射amylin,结果发现,amylin注射后各项生化指标均增加,差异显著,且amylin在肾脏的表达亦增加,说明amylin有促进ORG病情恶化的作用。由此,我们可以得出以下结论,即amylin在ORG发生发展过程中发挥重要作用,与在DN中产生的结果相同,其次,amylin可能有望成为ORG的治疗靶点,有效的延缓病情的进展。

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