赵 岳,宋 莹,徐凯成*,赵吉生

(1.吉林大学中日联谊医院,吉林 长春130033;2.吉林大学第二医院)

囊泡相关膜蛋白synaptobrevin/VAMP和syntaxin相互作用调节细胞内特异性囊泡运输[1,2]。synaptobrevin/VAMP与突触小体相关蛋白Snap25共同形成复合体[3,4],Snap25主要存在于脑组织,其同源体广泛分布于于各个组织。其中Snap23的结构和功能与Snap25相似,分子量为23 KD,与多种syntaxins/VAMPS紧密结合,参与囊泡的定向靶向和囊泡与细胞膜的融合过程。Snap23可与许多蛋白相互作用。本研究应用荧光共振能量转移的方法,检测snap23与Munc 18c是否有相互作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 pEYFP-N1质粒购自Clontech,RNA提取试剂盒、DNA回收试剂盒购自QIAGEN;PECFPMunc 18c由德国惠赠。XhoⅠ和KpnⅠ内切酶、小规模质粒提取试剂盒、PCR纯化剂盒购自TAKARA。PfuTaq酶、Lipofectamine Plus Reagent购自 ROCHE。GFP抗体购买自Santa Cruz公司。PCR引物合成及DNA测序由TAKARA公司完成。胎牛血清、IMDM培养基购自HYCLONE。CHO细胞购买自中科院上海细胞所,DH5α菌由本院中心实验室保存。

1.2 Snap23基因的扩增 自人肌肉组织中提取总RNA逆转录为cDNA为模板进行PCR扩增。引物序列如下:Senseprimer:5'-GGGCTCGAGATGGATAATCTGTCATCAGAAG,Antisense primer:5'-GGGGACGTCTTAGCTGTCAATGAGTTTCTT。反应条件如下 :50 μ l 反 应体 系,cDNA 模板 2 μ l,dNTP(2.5 μ mol/l)5 μ l,引物(20 μ mol/l)各 1 μ l,pfuTaq 酶(5 ×106U/L)0.5 μ l,10×Pfu buffer 5 μ l,其余用水补足 。热循环程序:预变性95℃5min,94℃变性1min,52℃退火30 s,72℃延伸1 min,总35个循环,最后一次72℃延伸10 min。PCR产物进行琼脂糖电泳分析。

1.3 pEYFP-Snap23载体克隆与鉴定 PCR产物切胶回收后进行双酶切,反应体系如下:XhoⅠ 1 μ l,KpnⅠ 1 μ l,10×buffer 4 μ l,PCR 产物34 μ l,37℃下酶切5小时;34 μ L pEYFP-N1载体(240 ng/ul)在相同条件下进行酶切,分别回收目的基因片段及线性化载体片段并用T4DNA酶连接16 h,转入DH5a感受态细胞,37℃培养过夜后在LB板(100 g/l氨苄)上挑取8个阳性克隆分别加入3 mL LB培养基中(100 g/l卡那)37℃水浴250RPM 震荡16 h,提取质粒酶切鉴定分析,选取4个克隆测序。

1.4 pEYFP-Snap23质粒转染CHO细胞 CHO细胞培养 含有10%胎牛血清的IMDM培养基,37℃5%CO2培养箱中培养,传代次数控制在30代之内,质粒转染:转染前日将细胞接种于六孔培养板中,每孔细胞约2×104。当融合率达70-80%时,更换无血清培养基,取 pEYFP-Snap23 质粒约 1 μ g,经 Lipofectamine plus regent作用3 h,加入10%胎牛血清培养,同时转染PEYFP-N1质粒作为阴性对照。

1.5 荧光观察免疫印迹鉴定 质粒转染48 h后荧光显微镜下观察并拍照后,细胞提取总蛋白进行免疫蛋白印迹分析。具体过程:冰上收集细胞,加入100 μ L RIPA 裂 解液 (10 mM NaPO4pH 7.4,0.3 M NaCl,0.1%SDS,1%NP-40,1%DOC,2 mM EDTA,2 mM PMSF),4℃震荡裂解30 min后,15 000 g离心30 min回收上清液并检测蛋白浓度后,总上样量50 μ g行SDS-PAGE电泳,转膜后5%脱脂牛奶封闭1 h,加入鼠抗人GFP抗体(1∶1 000)4℃孵育过夜,洗脱后加入羊抗鼠IgG(1∶1 000)孵育1 h,TBST洗涤后扫描并拍照。

1.6 荧光共振能量转移

1.6.1 pECFP-Munc 18c和 pEYFP-Snap23共转染CHO细胞。CHO细胞接种于6孔培养板,pECFPMunc 18c和PEYFP-Snap23共转染48h后接种于多聚赖氨酸包被过夜的培养玻片上。

1.6.2 选择性受体漂白荧光共振能量转移条件YFP excitation:514 nm;Emission,545/40 nm;CFP:Excitation,457 nm;Emission,485/30 nm。

2 结果

2.1 以Snap23特异性引物进行PCR扩增后,电泳图谱显示在0.7 kb处见到有一处特异性很强的条带,见图1。

图1 人Snap23 PCR结果

2.2 在pEGFP-snap23 LB培养板上选取转化后8个阳性克隆进行酶切鉴定,经XhoⅠ和KPNⅠ双酶切后,可见克隆2,3,4,5,6出现0.7 KB的特异性DNA片段。选取2,3,4,5克隆经宝泰克公司自动测序仪进行序列分析,证明所获得的cDNA片段与genebank序列完全符合,见图2。

2.3 利用脂质体法将PEYFP-SNAP23转染至CHO细胞中,荧光显微镜下可见明显荧光,可见Snap23蛋白是一种可溶性蛋白,主要表达细胞核以外的细胞质上。转染PEYFP-N1质粒作为对照,可见EYFP蛋白分布在包括细胞核在内的整个细胞上,见图3。

2.4 利用western-blot方法鉴定pEYFP-Snap23在CHO细胞中的表达,Western结果显示pEYFP-Snap23成功表达,见图4。

2.5 荧光共振能量转移结果表明,Munc 18c和snap25存在相互作用,FRET为15.87%+0.5562(N=89),较对照组(ECFP-与YFP-N1)FRET(5.8%+0.082)明显增高,有统计学意义,见图5。

图2 XhoⅠ和KpNⅠ酶切鉴定 pEGP-Snap23

图3 A PEYFP-Snap23转染至CHO细胞中

图3 B pEYFP-N1转染至CHO细胞中

图4 免疫蛋白即迹检测pEYFP-Snap23蛋白表达

图5 CFP-Munc 18c和YFP-Snap23荧光共振能量转移结果

3 讨论

囊泡转运在细胞内成分和信息交换过程中起到重要作用,在转运过程中,而囊泡与质膜融合的胞吐过程是由可溶性N-乙基-敏感因子连接物复合体(Soluble N-ethyl-maleimide-sensitive fusion factor attachment protein receptor,SNARE)。SNAREs是一个多功能的蛋白家族,根据亚细胞定位不同,分为囊泡上的VSNARE和质膜上的T-SNARE,V-SNARE和T-SNARE形成复合体,共通催化膜融合。Snap23是T-SNAER的亚类蛋白,表达于多种组织,在非神经细胞的胞吐中起重要作用。已有研究证明:snap23蛋白和多种蛋白有相互作用,包括 STX2,NAPA,KIF5B,STX6,SYBL1,VMP3,STX4等[5]。近些年发现,SNARE蛋白间的结合也可能通过其他蛋白,如Rab,munc18,SNIP和synip[6]进行调节。Munc 18是一种在调节囊泡锚定,融合和胞吐作用中扮演重要角色的蛋白质。哺乳动物Munc 18蛋白由三种亚类组成,分别是Munc 18a,Munc18b和Munc 18c[7],有研究表明Munc 18C与STX4结合从而抑制囊泡锚定与融合。本研究通过荧光共振能量转移明确Munc 18C是否可以与Snap23蛋白有相互作用。

荧光共振能量转移是近些年发展起来的新技术,是研究蛋白质相互作用的有力武器。其基本原理是:当供体荧光分子受到激发时,其发射光谱与受体荧光分子的激发光谱有重叠部分,并且二者距离很近(＜10 nm)时,受体可被供体所激发,荧光增强[8]。在本实验中,我们以CFP和YFP作为配对来研究Munc 18C和Snap23之间有无相互作用。结果证明,当CFP-Munc 18C被激发时,可以将能量传递给YFP-Snap23,即发生FRET,证明二者之间可能存在相互作用,但是相互作用的机制以及其影响因素还需进一步研究。

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