张 恒,王月英,吴红英,李德冠,王小春,路 璐,常建辉,翟志斌,孟爱民

(北京协和医学院中国医学科学院放射医学研究所天津市分子核医学重点实验室,天津300192)

再生障碍性贫血(Aplastic Anemia,AA再障),系多种病因引起的造血障碍,导致红骨髓总容量减少,造血衰竭,全血细胞减少为主要表现的一组综合征[1]。其发病机制除与造血干细胞本身缺陷、造血微环境损伤有关外,免疫功能是再障重要的发病原因。对AA临床患者研究表明[2,3],AA患者外周血CD4+细胞比例降低,CD8+细胞比例升高,CD4+/CD8+比值失调;此外T细胞活化相关的共刺激分子CD40、B7(CD80/CD86)等也参与了AA的发病过程,并对患者预后有重要影响。

AA动物模型构建方法有物理方法、化学方法、免疫介导方法和混合方法。评估指标主要包括,全血细胞、网织红细胞减少,骨髓象三系血细胞减少[1,4];但目前还未见对AA动物模型的免疫学指标进行评价。开展对AA动物模型免疫学相关指标的评估,有利于对AA动物模型有效性的科学评价,有利于评估新疗法在患者免疫学指标的改善。在我们的研究中,我们参照了Barnes等的报道[5],采用电离辐射和免疫介导结合的方法诱导小鼠AA模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物 近交系DBA/2小鼠2只,22-24 g,雄性,由中国医学科学院实验动物研究所提供(合格证号:SCXK(京)2005-0013)。近交系BALB/C小鼠30只,20-22 g,雄性,由中国辐射防护研究院提供(动物许可证编号:SCXK(京)2007-0001)。全价清洁饲料由北京科奥协力饲料有限公司提供。

1.2 试剂 Anti-Mouse TER-119(ly-76)-biotin、Anti-Mouse Ly-6G(Gr-1)、Anti-Mouse CD11b、Anti-Mouse CD5(Ly-1)、Anti-Mouse CD45R(B220)、Anti-Mouse CD4-FITC、Anti-Mouse CD8-PE、Anti-Mouse CD40-FITC 、Anti-Mouse CD80-FITC 、Anti-Mouse CD86-PE,以及鼠IgG1-PE、IgG1-FITC均eBioscience产品。

1.3 照射条件 天津市物理技术研究所60Co源γ射线,剂量为5.0Gy,剂量率为1.1Gy/min。

1.4 动物模型建立方法

1.4.1 动物分组 取生长良好的BALB/C小鼠30只,随机分为 3组,每组10只,即对照组、照射组、AA模型组。对照组进行假照射,照射组和AA模型组进行照射。

1.4.2 AA动物模型制备 将DBA/2小鼠(供鼠)颈椎脱臼法处死,常规消毒后,在超净工作台中无菌取出胸腺,置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中,除去粘附的结缔组织、剪碎、轻磨、200目不锈钢网过滤,制成单细胞悬液,台盼蓝鉴定细胞活性(在95%以上),计数后用RPMI-1640培养液调细胞浓度为5×106/ml备用。BALB/c小鼠经5.0 Gy剂量60Co源γ射线全身照射,4 h后经尾静脉输人DBA/2小鼠的胸腺细胞悬液0.2 ml/只,含细胞数为1×106个,建立AA小鼠模型10只。对照组和照射对照组尾静脉注入等量的 RPMI-1640培养液。实验第15日检测各项指标评估动物模型是否成功构建。

1.5 评价实验方法

1.5.1 外周血常规指标测定 模型制备至第15日,小鼠眼球取血200μ l,EDTA-K3抗凝,用自动血细胞计数仪(pocH-100i,希森美康,日本)测定外周血白细胞数(WBC)、红细胞数(RBC)、血红蛋白含量(HGB)、血小板(PLT)等指标;取抗凝血100μ l,1%煌焦油蓝染色后镜下计数网织红细胞(Ret)。

1.5.2 骨髓有核细胞计数处死小鼠,取小鼠左侧股骨,用2 ml冲洗液冲出骨髓,在血细胞计数仪上测定骨髓有核细胞数(BMMNC)。

1.5.3 免疫学分型检测 抗凝外周血和骨髓冲洗细胞用0.83%NHCl3裂解红细胞后,分别加入相应抗体进行避光孵育,加入PBS终止反应并用200目滤网过滤,送流式细胞仪(EPICS ALTRA,Beckman Coulter,美国)进行检测,用EXPO32软件采集数据并用EXPO32 Analyze软件分析数据。外周血检测CD4、CD8、B220、CD40、CD80/86 等指标 ,骨髓有核细胞检测 CD5、B220、Gr-1、Ter-119 、CD11b 等指标 。

1.6 统计学分析 所有资料处理用SPSS16.0版软件包进行分析,检测结果以±s表示,经 Levene检验后,采用LSD法检验比较组间差异,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血常规指标测定 外周血各项指标中AA模型组小鼠与对照组相比见表1,WBC降低70.2%(P＜0.05),PLT降低39.4%(P＜0.05),RBC降低19.9%(P＜0.05),HGB降低17.0%(P＜0.05),Ret降低30.4%(P＜0.05);IR组与对照组相比,WBC降低52.1%(P＜0.05),其余指标无统计学差异。

表1 AA模型小鼠实验外周血常规及网织红细胞计数(±s)

表1 AA模型小鼠实验外周血常规及网织红细胞计数(±s)

*与Control组相比 P＜0.05,#与IR Control组相比P＜0.05

组别 WBC(109/L) RBC(1012/L) HGB(g/L) PLT(109/L) Ret(‰)Control 6.30±0.36 8.74±0.98 145.0±12.1 1016.4±88.1 86.2±10.7 IR Control 3.02±0.93* 8.04±0.90 132.2±12.3 816.2±128.1 69.8±8.2 AA模型 1.88±0.33*# 7.00±0.73* 120.4±15.1* 616.2±125.3* 60.0±18.9*

2.2 骨髓有核细胞免疫学分型 每只小鼠均取左侧股骨冲洗骨髓后计数BMMNC,AA模型组较对照组低51.84%(P＜0.05)。流式细胞仪检测细胞表面抗原进行分型,见表 2,AA模型组Gr-1+、Ter-119+、CD11b+细胞比率均低于对照组(28.52%,P＜0.05;75.63%,P＜0.05;10.22%,P＞0.05);AA模型组CD5+、B220+细胞比率高于对照组(51.28%,P＜0.05;78.21%,P＜0.05)。IR组与对照组相比,只有BMMNC计数和B220+细胞2项指标有显著性差异。

表2 AA模型小鼠骨髓有核细胞计数及免疫分型(±s)

表2 AA模型小鼠骨髓有核细胞计数及免疫分型(±s)

*与Control组相比 P＜0.05,#与IR Control组相比P＜0.05

组别 BMMNC×106/股骨 CD5+(%) B220+(%) Gr-1+(%) Ter-119+(%) CD11b+(%)Control 22.56±3.19 1.90±0.59 6.10±6.86 80.28±8.57 5.18±1.75 66.72±11.17 IR 14.08±2.68* 3.76±0.84 21.28±11.80* 69.62±10.39 3.84±1.24 70.42±7.06 AA模型 10.00±2.17* 3.90±1.43* 28.52±9.17* 57.38±15.46* 1.26±0.30*# 59.90±9.52

2.3 外周血免疫学分型 外周血裂解红细胞后对有核细胞进行免疫学分型,如表3所示。T淋巴细胞分型数据中,AA模型组CD4+细胞比例低于对照组42.49%(P＜0.05),CD8+细胞比例高于对照组100.59%(P＜0.05),CD4+/CD8+比例低于对照组(0.74±0.21%比2.32±0.88%,P＜0.05);T细胞活化相关的指标中,AA模型组CD80/86+细胞和CD40+细胞均高于对照组(75.97%,P＜0.05;48.50%,P＜0.05);在对B220+检测中各组间均未出现具有统计学意义的差异。IR组CD80/86+细胞比例高于对照组,与AA模型组趋势相反,其余各指标均与对照组无统计学差异。

3 讨论

再生障碍性贫血是一组以造血组织功能衰竭为特征的综合征,对外周血常规检测和骨髓象分析是AA动物模型的基本评估方法[1,4,6]。在我们的研究中,建模第15天AA模型组小鼠外周血RBC、PLT、RBC、HGB和Rct显著下降并具有统计学差异。骨髓有核细胞计数及分型结果如表2,AA模型小鼠骨髓有核细胞数量低于对照小鼠,Gr-1+细胞、Ter-119+细胞所占百分比和绝对数值均显著低于对照组小鼠,CD11b+细胞百分比在各组间没有显著性差异,但AA模型组CD11b+细胞的绝对数值低于对照组57.77%,这表明AA模型组小鼠骨髓三系细胞均显著低于对照组小鼠。AA模型组小鼠骨髓单核细胞中CD5+细胞和B220+细胞百分比高于对照组,提示骨髓中淋巴细胞比例增高,可能是骨髓中出现了较强的免疫反应所致,与相关研究报道相符[7]。我们构建的AA小鼠模型,在外周血常规检查、骨髓细胞计数及分型等指标均符合AA动物模型的要求,与临床AA患者各项指标相符或相近,说明我们构建的AA动物模型是成功的。相比之下IR组仅有个别指标与对照组具有显著性差异,表明仅用4Gy剂量IR是不能单独有效构建AA动物模型的。对骨髓单核细胞利用流式细胞技术检测各系血细胞比例,相比骨髓涂片镜下检测速度更快,结果更客观和全面。

近年研究发现,AA的发病机制除与造血干细胞本身缺陷、造血微环境损伤有关外,免疫异常是一个重要的因素,细胞免疫紊乱参与再障的发病。CD4+细胞是具有辅助诱导性T细胞亚群(Th),其增多表示B细胞产生的免疫球蛋白增多及细胞免疫增强;CD8+是抑制性细胞(Ts)细胞毒性细胞(Tc)亚群,其增多表示免疫抑制;CD4+/CD8+比值表示Th与Ts之间功能平衡状态,是人体免疫系统内环境稳定的重要指标,比值降低可引起机体免疫功能紊乱。我们研究中外周血免疫学分型结果表明(表3),AA模型小鼠CD4+细胞比例低于对照组,而CD8+细胞比例高于对照组,CD4+/CD8+比例倒置,提示在我们构建的AA动物模型中T细胞功能紊乱,细胞免疫参与了AA的发生,这与临床AA患者情况基本相符[3]。

CD40分子属于肿瘤坏死因子受体超家族,是I型膜蛋白,主要表达于抗原提呈细胞,其配体CD40L(CD154)主要表达于活化T细胞。CD40与CD40L的相互作用,不仅通过B细胞调节体液免疫应答,而且可以增强T细胞、巨噬细胞等免疫功能,诱导细胞因子的产生。CD40异常表达是AA患者免疫功能紊乱的原因之一,并介导了对AA患者造血机能的破坏。我们的研究表明,AA模型小鼠外周血CD40+细胞比例显著高于对照组,提示在我们构建的AA动物模型中抗原递呈加强,体液免疫和细胞免疫都可能增强并参与AA的发生,这与临床AA患者研究结果相符[8]。

T细胞免疫应答是激发信号和抑制信号平衡的结果。CD28是T细胞最重要的共刺激分子,B7(CD80/86)分子表达于抗原提呈细胞上,是CD28的配体分子。CD28/B7是主要的正向共刺激分子,通过促进白细胞介素2(IL-2)分泌,延长淋巴细胞寿命,促进CD4+T细胞向Th1分化,诱使 Thl/Th2失衡,增加CD8+T细胞数量和质量,维持T细胞介导的免疫应答[9]。国内外多项研究表明,B7高表达,CD28/B7功能紊乱是AA发病中重要的环节[10]。在我们的研究中,AA模型小鼠外周血B7(CD80/86)分子表达水平显著高于对照组,提示在我们构建的AA动物模型中通过共刺激分子途径增强了细胞免疫,可能参与了AA的发生,这与临床AA患者研究结果相符[9,10]。

总之,我们成功构建了AA的动物模型,在血常规、骨髓象等传统评估项目上符合AA临床诊断标准。此外我们还对外周血免疫学相关指标进行了检测,其中T细胞分类、功能等相关指标与临床AA患者的表现相符。今后,我们还需要对更多与AA致病相关免疫学指标进行评估,充分利用包括免疫学指标的AA动物模型及检测平台,对AA的新疗法进行更全面的评估。

[1]Gaman A,Gaman G,Bold A.Acquired aplastic anemia:correlation between etiology,pathophysiology,bone marrow histology and prognosis factors[J].Rom J Morphol Embryol,2009,50:669.

[2]Zeng W,Nakao S,Takamatsu H,et al.Characterization of T-cell repertoire of the bone marrow in immune-mediated aplastic anemia:evidence for the involvement of antigen-driven T-cell response in cyclosporine-dependent aplastic anemia[J].Blood,1999,93:3008.

[3]张 熔,李运碧,李 戈,等.32例再生障碍性贫血患儿淋巴细胞免疫分析及临床意义[J].现代临床医学,2009,35:17.

[4]BloomM L,WolkA G,Simon-Stoos K L,et al.A mouse model of lymphocyte infusion-induced bone marrow failure[J].Exp Hematol,2004,32:1163.

[5]Barnes D W,Mole R H.Aplastic anaemia in sublethally irradiated mice given allogeneic lymph node cells[J].Br J Haematol,1967,13:482.

[6]Faiola B,Fuller E S,Wong V A,et al.Exposure of hematopoietic stem cells to benzene or 1,4-benzoquinone induces gender-specific gene expression[J].Stem Cells,2004,22:750.

[7]Hirano N,Butler M O,Von Bergwelt-Baildon,et al.Autoantibodies frequently detected in patients with aplastic anemia[J].Blood,2003,102:4567.

[8]Fan Y,Ge Y,Zhu H,et al.Characterization and application of two novel monoclonal antibodies against CD40L:epitope and functional studies on cell membrane CD40L and studies on the origin of soluble serum CD40L[J].Tissue Antigens,2004,64:257.

[9]Oh S,Hodge J W,Ahlers J D,et al.Selective induction of high avidity CTL by altering the balance of signals from APC[J].J Immunol,2003,170:2523.

[10]Kaito K,Otsubo H,Usui N,et al.Th1/Th2 lymphocyte balance in patients with aplastic anemia[J].Rinsho Byori,2004,52:569.