张阳东,温新宇,董 矜,楚瑞雪,田亚平*

(1.解放军第二炮兵总医院 检验科,北京100088;2.解放军总医院 生化科,北京100853;3.解放军第二炮兵礼士路门诊部,北京100820)

近年来,随着人们生活水平的提高和生活方式的改变,冠心病(CAD)已成为当今危害我国人民健康和生命的主要疾病。CAD的基因机制及基因检测在CAD诊断中的应用研究日益受到重视。单核苷酸的多态性(SNP)造成了人类在疾病易感性等方面的不同。SNP的基因型频率、等位基因频率及单倍体型频率都可能与疾病相关。标签SNP是指能代表一个染色体区域其他众多位点信息的SNP位点。检测SNP进行疾病的相关性分析,可以从遗传的角度将疾病的基因诊断提高到单碱基水平。本研究通过提取人体外周血中白细胞的DNA,根据文献及国际单倍型图工程数据库(Hapmap,http://www.hapmap.org)检索,选择中国汉族人群CAD相关基因内收蛋白1(ADD1),血小板内皮细胞黏附分子-1(PECAM-1),C-反应蛋白(CRP),内皮固有型一氧化氮合酶(ecNOS),浆细胞膜糖蛋白1(PC-1),L-选择素(SELL),G蛋白β亚单位(GNB3),血管紧张素I转换酶(ACE),血管紧张素II 1型受体(AT1R),血管紧张素原(AGT),细胞间黏附分子-1(ICAM-1),亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和肝脂肪酶基因(HL)等13个基因的44个标签SNP,设计合成引物,应用SNP Stream基因分型系统构建检测多重SNP的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂 AG型PCR仪购自德国Eppendorf公司。SNP Stream基因分型系统购自美国Beckman Coulter公司。多重SNP检测实验所用dNTP购自日本TaKaRa公司,PCR缓冲液、氯化镁、Gold Taq酶购自瑞士Roche公司,外切酶Ⅰ购自新英格兰BioLabs公司,虾硷性磷酸酶及其缓冲液、灭菌双蒸水购自美国Promega公司,余试剂购自美国Beckman Coulter公司。

1.2 PCR引物的设计和合成 实验相关的基因名称、编码,SNP编码及突变类型见表1。

表1 SNP相关的基因、突变类型及样本检出率

应用美国Beckman Coulter公司的AP Editor软件,在www.autoprimer.com上在线完成引物设计并由北京赛百盛基因技术有限公司合成。每个SNP共设计3个引物,其中2个为PCR扩增引物,用于扩增出含有目的SNP位点的片断;1个为延伸引物,用于SNP位点的测序及与玻璃芯片上的寡核苷酸链杂交。SNP的PCR引物及延伸引物碱基序列见表2。

表2 SNP引物碱基序列

接上表

接上表

1.3 多重PCR扩增及纯化 用灭菌双蒸水将样品DNA稀释到2-10 ng/μ l。稀释并混合PCR引物使其终浓度为2.5μ M,稀释并混合延伸引物使其终浓度为5 μ M。96孔板的每个反应孔中加入由引物,dNTP,缓冲液,氯化镁,Taq酶和灭菌双蒸水构成的反应液3 μ l,对应每孔内加入稀释后的样品DNA 2 μ l,PCR总反应体积为 5 μ l。扩增条件:94℃变性1 min,然后进入40次循环(94℃变性30 sec,55℃退火30 sec,72℃延伸1 min),最后25℃保温10 min。在扩增产物中加入3 μ l由外切酶Ⅰ、虾硷性磷酸酶和灭菌双蒸水配制的纯化液。纯化反应条件:37℃30 min,96℃10 min,25℃10 min。

1.4 延伸 每个反应孔中加入7 μ l由延伸缓冲液,混合延伸引物,荧光标记的双脱氧核苷酸T/C和A/G,DNA聚合酶和灭菌双蒸水配制的延伸液。延伸反应条件:96℃3 min,进入40次循环(94℃20 sec,40℃11 sec),25℃保温10 min。

1.5 洗板 吸取20倍稀释后的冲洗缓冲液1(20X Wash Buffer 1)20 μ l加入到杂交板上的每个孔中,将杂交板翻过来放在无尘纸上,一起放在离心机的托盘内进行离心,使杂交板上每个孔中的清洗液全部脱离,离心速度为 1 000 RCF(2 665 r/min),每次离心1 min,一共洗涤3次。

1.6 杂交 在延伸产物中加入8 μ l杂交液,混匀后取15 μ l加入杂交板反应孔中,42℃杂交 2 h。1 000 RCF离心甩干。吸取20倍稀释后的冲洗缓冲液2(60X Wash Buffer 2)20 μ l加入到杂交板上的每个孔中,离心甩干,一共清洗3次。

1.7 扫描 在SNPstream V2.2软件中输入与杂交板每个反应孔对应的样品信息,导入引物位点文件并建板,扫描杂交板后通过该软件分析扫描信号,校正偏离位点,调整基因型的边界线并导出结果。

2 结果

2.1 SNP的结果扫描分析 延伸反应中SNP位点结合上荧光标记的双脱氧核苷酸T(蓝色)/C(绿色)和A(蓝色)/G(绿色)后,通过杂交,经SNP Stream基因分型系统扫描,可以获得三种颜色的扫描结果,即纯合型的蓝色(B)或绿色(G),杂合型的橙色。实验中每份标本均设有1个阴性,2个纯合型,1个杂合型共4个质控对照点。扫描图的横坐标为荧光强度相对值B/(B+G),纵坐标为荧光强度对数值。图1所示5个扫描图依次为阴性质控位点,纯合XX型质控位点,杂合XY型质控位点,纯合YY型质控位点和标本的SNP扫描结果。

图1 SNP的扫描结果

2.2 反应体系中SNP的检出率 反应体系由13个基因共44个SNP组成。通过对583份DNA标本进行检测,共获得12个基因32个SNP的基因分型结果,基因分型的成功率为72.7%。而分型成功的32个SNP的平均样本检出率为98.3%。SNP的样本检出率见表1。

3 讨论

目前SNP的检测方法主要有测序、高效液相色谱、限制性酶切、基因芯片和实时荧光定量聚合酶链反应等[1-3]。这些方法只能检测一个或少数几个SNP,不适合多个SNP、多种类型SNP和大批量标本的检测。

美国Beckman Coulter公司的SNP Stream基因分型系统是一套高自动化、高通量的SNP基因分型系统。它将多重PCR技术与荧光标记单碱基延伸分型技术结合起来。其基本原理是单碱基延伸和标签微阵列。单碱基延伸法又称微测序法,是在双脱氧测序法的基础上发展出来的SNP检测方法。首先用PCR的方法从基因组DNA中扩增出含有目的SNP位点的片断,用一条与SNP位点上游序列相匹配的引物进行“测序反应”,并在反应中加入荧光标记的双脱氧核苷酸,使得这个“测序反应”在测出SNP位点的碱基后便终止了。虽然该方法基于测序原理,但由于只需测一个碱基,因而极大地提高了结果的准确性。该系统同时引入标签微阵列芯片杂交技术,将寡核苷酸微阵列技术应用于常规的384孔板内。标签微阵列是在玻璃芯片板的板底预先合成上几十条交叉杂交率最低、与数据库中各种基因组同源性极小,并能提供很强信号的单链寡核苷酸链(标签),与这些标签互补的带有荧光标记的寡核苷酸链能通过杂交结合上去,然后扫描检测其荧光标记。结果由成像仪根据标记的双脱氧核苷酸的双色荧光读出,根据标签标记的荧光不同,从而将与标签互补的不同寡核苷酸链区别开。该系统不需要新的设备和试剂,只需要稍微改变实验方法,就可以在同一实验体系中同时对4种类型多至48个SNP位点进行大批量样本快速检测。目前该系统已广泛应用于大样本多SNP位点的检测[4-6]。

本研究应用Beckman Coulter公司的SNP Stream基因分型系统,在构建CAD相关基因多重SNP分型检测法的实验体系中共设计44个SNP的基因分型。实验中发现2 ng的DNA就足够进行44重SNP的检测,即每个SNP位点只需要0.045 ng的DNA。由于不同基因扩增反应间引物的竞争及引物的融解温度存在差异等影响因素,本实验共获得32个SNP的基因分型结果,基因分型的成功率为72.7%(32/44)。通过对583份DNA标本进行检测,分型成功的32个SNP的平均样本检出率为98.3%。32个SNP包括C/T,A/G,G/T和A/C四种类型,每一类型均有较高的检出率。总之,我们应用Beckman Coulter公司的SNP Stream基因分型系统构建的32重SNP基因分型方法具有快速、准确、高通量、操作简单、微量化并可同时检测最多4种SNP类型等优点。

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