文 / 潘丽娜 熊尉杰 张岩春 戴智勇 段潇潇 袁 晓

1 澳优乳业（中国）有限公司 2 湖南澳优食品与营养研究院

益生菌是一种定植于人体肠道内的有益微生物的总称，其能通过改善肠道内微生物的平衡而对宿主产生一种或多种益处[1，2]。目前被人类广泛应用的益生菌有双歧杆菌、乳杆菌、肠球菌、大肠杆菌、枯草杆菌、蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌和酵母菌等。其中用于婴幼儿奶粉中的益生菌一般为双歧杆菌和乳杆菌2 种类型。常见的双歧杆菌有婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌等；乳杆菌为嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌和罗伊氏乳杆菌等。

益生菌奶粉是在奶粉中添加了活体益生菌的奶粉，在常温贮存时，益生菌的活菌数会随着时间的推移而呈下降趋势，缩短产品的保质期。因此，需要通过稳定性试验，考察益生菌奶粉中的活菌数在不同环境条件下随时间变化的规律，以认识和预测益生菌奶粉的稳定性。本研究就是根据益生菌的特点，用影响最大的温度因素为试验条件，检测不同温度和贮存时间下的活菌数，为益生菌奶粉贮存、运输条件的确定和有效期的建立提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

双歧杆菌（Bifidobacterium，BB12）（活菌数≥3×1010CFU/g）；丹麦科·汉森公司的婴幼儿配方奶粉（双歧杆菌BB12添加量为400 mg/kg）。

1.2 主要设备

超洁净工作台DL-CJ-2ND（哈尔滨东联），电热恒温培养箱DH3600（天津市泰斯特仪器厂），冰箱（海尔公司），电子天平AL204（梅特勒托利多仪器上海有限公司）等。

1.3 培养基

莫匹罗星锂盐改良MRS培养基[3]：1 L培养基中含有50 mg莫匹罗星锂盐，蛋白胨10.0 g，牛肉粉5.0 g，酵母粉 4.0 g，葡萄糖 20.0 g，吐温80 1.0 mL，K2HPO4·7H2O 2.0 g，醋酸钠·3H2O 5.0 g，柠檬酸三铵 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·4H2O 0.05 g，琼脂粉15.0 g， pH值 6.2。

1.4 菌的培养和活菌数检测方法

称取待测奶粉25 g，置于装有225 mL生理盐水的无菌均质杯内，8000 rpm，均质1 min，制成1:10的样品匀液；用微量移液器吸取样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于装有9 mL生理盐水无菌试管中，振摇试管使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。另取微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10 倍倍比稀释。选择2 个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1 mL样品匀液涂布于莫匹罗星锂盐改良MRS 琼脂平板，使用L型灭菌棒进行表面涂布，每个稀释度做2 个平行，（36±1） ℃厌氧培养48 h后，计数平板上的所有菌落数。

1.5 统计方法

将同一批次生产的澳优A选（400 g复合薄膜充氮包装），分别在30、40 ℃恒温箱中放置60 天，每隔6 天取样检测益生菌活菌数残留量；在50、60 ℃恒温箱中放置10 天，每隔1 天取样检测益生菌活菌数残留量；以贮藏在（-18±2） ℃的低温冰箱中的奶粉样品为对照，平行测定其益生菌活菌数残留量。用Microsoft Office Excel 2003进行数据处理。

图1 益生菌奶粉30及℃贮藏条件下活菌数变化

图2 益生菌奶粉高温条件下活菌数变化

2 结果与分析

2.1 30 ℃及40 ℃条件下贮藏试验结果

从表1和图1可以看出：

（1）益生菌奶粉在30 ℃条件下贮藏60 天，其活菌数呈缓慢下降趋势，36天时下降了26.7%，试验结束时下降了46.7%，具体数量为8.0×106CFU/g（低温对照数量为1.4×107CFU/g）；而益生菌奶粉在40 ℃条件下贮藏30 天，其活菌数下降趋势较30 ℃条件下明显，12天时下降了38.6%，试验结束时下降了64.3%，具体数量为5.0×106CFU/g（低温对照数量为1.0×107CFU/g）。

（2） 试验数据显示，益生菌奶粉在30 ℃条件下放置2 个月、在40 ℃条件下放置1 个月，其活菌数均远大于1×106CFU/g，符合国家标准。但由于生产过程中存在混合不均匀的情况，会有出厂时活菌数仅略大于1×106CFU/g的极端事件出现，这样的产品的贮藏时间会缩短。

（3）在30 ℃条件下第24 天和第30 天以及在40 ℃条件下第12 天，活菌数有突然增高的趋势，可能是由于生产过程中混合不均匀造成的产品批次不同而产生的活菌数差异。

表1 30及40 ℃贮藏条件下益生菌奶粉中的益生菌活菌残留数 单位：CFU/g

表2 高温（50、60 ℃）条件下益生菌活菌残留数 单位：CFU/g

2.2 高温（50、60 ℃）条件下贮藏试验结果

从表2和图2可以看出：

2.2.1 益生菌奶粉在50 ℃条件下保存，第3 天活菌数下降了1 个数量级，从1.5×107CFU/g下降为4.4×106CFU/g；第10 天再次下降1 个数量级，从原来的2.9×106CFU/g下降为1.5×105CFU/g。

2.2.2 试验数据显示，益生菌奶粉在50 ℃条件下放置1 周，其活菌数大于1×106CFU/g，符合国家标准。但由于生产过程中的分布不均匀，存在出厂时活菌数仅略大于1×106CFU/g的情况，这样的产品的活菌数维持合格（活菌数大于1×106CFU/g）的时间会缩短。

2.2.3 益生菌奶粉在60 ℃条件下保存，第3 天活菌数下降了2 个数量级（从2.4×107CFU/g下降为3.1×105CFU/g），第5 天即发生褐变，故停止该部分试验。

2.2.4 试验数据显示，益生菌奶粉不适宜在60 ℃条件下放置。

2.3 低温对照试验结果

从表3和图3可以看出，益生菌奶粉在（-18±2） ℃低温保存，活菌数基本保持稳定。

3 结论

益生菌在（-18±2） ℃低温保存活菌数基本保持稳定，在30 ℃条件下放置2 个月、在40 ℃条件下放置1 个月，其活菌数均远大于1×106CFU/g，符合国家标准。在50 ℃条件下放置1 周其活菌数大于1×106CFU/g，符合国家标准。在60 ℃条件下保存，第3 天活菌数下降了2 个数量级，第5 天即发生褐变，结果显示，益生菌奶粉不适宜在60 ℃条件下放置。■

图3 30 ℃和40 ℃时的低温对照活菌数变化曲线图

表3 -18 ℃的低温条件下奶粉活菌残留数 单位：CFU/g

[1]梁金忠. 益生菌研究进展及在食品工业中的应用. 见：中国食品添加剂生产应用工业协会主编.第十一届中国国际食品添加剂和配料展览会学术论文集. 2007.

[2]Gotcheva V，Hristozova E，Hristozova T，et.al. Assessment of potential probiotic properties of lactic acid bacteria and yeast strains. Food Biotech，2002，21（16）：211-225.[3]GB 4789.35—2010.