江奋霞 张浩 刘绪平 张春华

注射用头孢他啶为第三代头孢菌素类抗生素，属于《中国药典》二部品种，有较强的抑菌性，故必须采用适当的方法消除其抑菌性才能进行无菌的检查。本文对该品种的无菌检查方法进行了方法学研究，通过研究，本样品可采用薄膜过滤法，用0.1%蛋白胨水溶液冲洗，冲洗量为每筒500 ml，分5次，100 ml/次，结果表明该方法有效可行。

1 仪器与试药

YXQ-LS-50SⅡ高压蒸汽灭菌器(上海博迅实业医疗器械有限公司);D8523CTL-2W格兰仕微波炉(顺德格兰仕微波炉电器有限公司);HTY-2000A集菌仪(杭州高德泰林有限公司);SW-CJ-2D净化工作台(苏州净化有限公司);Heal Force-900C生物安全柜(上海力申科学仪器有限公司);PYXDHS细菌培养箱(上海跃进医疗器械厂)、MJ-160B霉菌培养箱(上海跃进医疗器械厂)。

试验菌种:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]、金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]、大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]、铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10104]、生孢梭菌 (Costridium sporogenes)[CMCC(B)64941]、白色念珠菌 (Candida albicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉 (Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]，由中国药品生物制品检定所提供。

硫乙醇酸盐液体培养基、改良马丁液体培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、改良马丁琼脂培养基、0.1%蛋白胨水溶液，由北京三药科技开发公司提供。注射用头孢他啶为江西东风药业股份有限公司提供，批号为090124-1，规格为1.0 g。

2 方法[1，2]与结果

2.1 菌液制备 取经35℃培养18～24 h的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单孢菌的新鲜营养肉汤培养物1 ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5～10-7，约为50～100 cfu/ml，做活菌计数备用。取经25℃ 培养24～48 h的白色念珠菌改良马丁液体培养物1 ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5～10-6，约为50～100 cfu/ml，做活菌计数备用。取经25℃ 培养1周的黑曲霉改良马丁斜面培养物，加5 ml 0.9%无菌氯化钠溶液洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子悬液1 ml，加0.9%无菌氯化钠溶液适量稀释，用标准比浊管比浊，其浊度与标准比浊管相当后，取1 ml稀释后的孢子悬液，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-4，约为50～100 cfu/ml，做活菌计数备用。取经35℃培养18～24 h的生孢梭菌硫乙醇酸盐液体培养物1 ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5-10-7，含菌数小于100 cfu/ml，备用。

2.2 供试液制备 按规定量取供试品，用0.1%蛋白胨水溶液适量溶解，作为供试品溶液。

2.3 无菌检查法的验证 采用一次性三联滤器，先将滤器用少量稀释剂润湿，使稀释剂顺利流出，再将供试品溶液抽入滤器;用0.1%蛋白胨水溶液冲洗，冲洗总量每筒分别为300，400，500 ml，滤干，将硫乙醇酸盐液体培养基、改良马丁液体培养基100 ml滤入三联滤器，加入少于100 cfu的试验菌，置温度35℃培养箱培养，3～5 d逐日观察结果见表1。

表1 菌落计数结果表

注射用头孢他啶无菌检查法(薄膜过滤法)观察不同冲洗量，对7株阳性代表菌抑菌的影响，加入适宜液体培养基，并同时做空白对照实验，置规定温度培养3～5 d，逐日观擦结果。见表2～8。

表2 人工污染大肠埃希菌结果

表3 人工污染金黄色葡萄球菌结果

表4 人工污染枯草杆菌结果

表5 人工污染铜绿假单孢菌结果

表6 人工污染生孢梭菌结果

表7 人工污染白色念珠菌结果

表8 人工污染黑曲霉菌结果

2.4 结果 从表2～8的结果可以看出，500 ml/筒冲洗，可使7株阳性菌生长良好。取规定量供试品，以适量0.1%蛋白胨水溶液溶解，按上述薄膜过滤法冲洗，7株阳性菌均可以正常生长，表明样品在经过每筒500 ml的冲洗消除了抗菌活性。经过无菌检查的方法学验证，本品无菌检查可采用薄膜过滤法，用0.1%蛋白胨水溶液冲洗，冲洗量为每筒500 ml，分 5 次，100 ml/次。

3 讨论

头孢他啶为第三代头孢菌素类抗生素。对大肠杆菌、肺炎克雷伯氏杆菌等肠杆菌科细菌和流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌等有高度抗菌活性，对硝酸盐阴性杆菌、产碱杆菌等亦有良好抗菌作用[3]。对于细菌产生的大多数β-内酰胺酶高度稳定，故其对上述革兰阴性杆菌中多重耐药菌株仍可具抗菌活性。肺炎球菌、溶血性链球菌等革兰阳性球菌对头孢他啶高度敏感，但本品对葡萄球菌仅具中度活性，肠球菌和耐甲氧西林葡萄球菌则往往对本品耐药。本品对消化球菌和消化链球菌等厌氧菌具一定抗菌，但对脆弱拟杆菌抗菌作用差。说明，本品的抗菌性较强。

鉴于头孢他啶有较强抗菌性，但又不能确定其对无菌检查有多大影响，故无菌检查采用依次渐进的方法来摸索合适的冲洗量和冲洗方法。根据对其抗菌性的分析，选择了大肠埃希菌为敏感菌株先进行试验，冲洗量为0.1%蛋白胨水溶液每筒300、400 ml时，阳性菌不能正常生长，冲洗量为0.1%蛋白胨水溶液每筒500 ml时，7株阳性菌均能正常生长。经过验证，本样品可以采用全封闭薄膜过滤法检查，冲洗量为0.1%蛋白胨水溶液每筒500 ml，分5次，100 ml/次。

[1]中华人民共和国国家卫生部药典委员会编.中华人民共和国药典.第二部.北京:化学工业出版社，2005.

[2]中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范.北京:中国医药科技出版社，2005.

[3]中华人民共和国国家卫生部药典委员会编.中华人民共和国药典临床用药须知，化学药和生物制品卷.人民卫生出版社，2005.