孙东杰，岳馨培，师 乐，孙成林，王 威

(郑州大学公共卫生学院劳动卫生与职业病学教研室 河南郑州 450001)

单核苷酸多态性(SNP)指染色体基因组水平上单个核苷酸变异。SNP检测中，聚合酶链反应－限制性片段长度多态性(PCR－RFLP)技术具有操作简单、特异性高、重复性好等优点，特别适用于已知突变位点检测［1］。对无合适内切酶或内切酶价格昂贵时，可引入错配碱基创造酶切位点(Create restriction site，CRS)方法设计引物，然后进行PCR-RFLP检测［2］。

该文总结了应用CRS方法结合PCR－RFLP原理对多个SNP检测方法的研究结果［3－6］，探讨了该方法在基因多态检测中的注意事项，为相关研究提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 试剂:2×PCR mix(MBI公司)，限制性内切酶MSPI(MBI公司)，琼脂糖(BBI公司)，引物由上海 Sangon公司合成。仪器:9600型PCR仪(PE公司)，微型电泳槽(Pharmacia Biotech，EPS1000)，Gel Doc 2000凝胶成像仪(Bio－RAD公司)。PCR产物测序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 方法 CRS－PCR－RFLP是根据引物碱基错配技术设计的检测单碱基突变的方法。其原理是根据单碱基突变位点的碱基替代情况设计引物，其中一条引物根据突变位点邻近序列设计，引入错配碱基，使得引物3’端和单碱基突变的一种突变型在PCR扩增后形成一个酶切位点，然后应用相应内切酶酶切鉴定。

1.3 序列查找及引物设计 在NCBI网站查找基因序列和SNP信息，结合文献确定多态碱基信息，利用Primer Premier5.0软件分析内切酶识别情况，设计引入错配碱基的引物并确定创造的酶切位点。

1.4 PCR扩增及酶切鉴定 取50 ng的基因组DNA、每个引物 0.2 μmol/L、1 × PCRmix、ddH2O 组成25 μl反应体系。PCR反应条件为首先94℃预变性5 min，然后94℃变性30 s，根据引物Tm值取(55～60)℃退火20 s，72℃延伸20 s，共30个循环后72℃延伸10 min。PCR后，取PCR产物10 μl，加入5 u内切酶和2 μl 10×酶切缓冲液和ddH2O组成20 μl反应体系，37℃水浴2～16 h后，电泳后凝胶成像观察。

2 结果

2.1 序列搜索与多态位点确定 查找NCBI的SNP数据库，收集 MGMT、ADH2、MTHFR和 PON2基因全序列及相关多态位点。各基因多态位点情况见表1。

2.2 序列分析与引物设计 经序列分析可知可识别原多态序列的内切酶及其价格情况，对价格较贵者进行错配分析。通过碱基错配将多态位点附近碱基进行替换，直至形成可被较廉价内切酶识别的序列。然后根据错配位点情况确定上下游引物的位置与长度(设计引物、选择的内切酶及其识别碱基情况见表1)。其中MGMT基因多态rs2308321和rs2308327因位点接近而设计一对特殊引物，两引物分别进行碱基错配，PCR后分别采用不同内切酶进行多态鉴定。

2.3 实验验证 通过PCR-RFLP实验验证，结果与预期一致。不同基因型PCR产物测序结果亦符合预期。

表1 基因多态位点信息与引物设计情况

3 讨论

应用CRS-PCR-RFLP进行SNP检测，拓宽了PCRRFLP的适用范围，在实际应用中具有很大的灵活性，具有较好的应用前景，特别适合于基层单位开展已知位点SNP的检测。综合考虑有关检测中出现的一些问题，CRS-PCR-RFLP技术的应用需要考虑以下问题。

3.1 SNP情况 SNP一般情况需全面掌握，主要包括基因名称、染色体位置、rs号、碱基序列及多态碱基替代(氨基酸替代)等。

3.2 内切酶情况 内切酶识别序列和价格因素要考虑，部分识别非回文序列的内切酶识别序列可能在2种以上，尽量筛选价格便宜者以利于推广。

3.3 扩增产物情况 扩增产物是否存在其他SNP位点、酶切位点个数及其切开后片段长度需考虑。切开后各个条带之间需具备可分辨性，一般两片段差异需超过长片段的10%，通常扩增产物长度为100～200 bp。考虑用琼脂糖凝胶电泳分辨，价格便宜，易于操作。必要时可考虑聚丙烯酰胺凝胶电泳。

3.4 引物设计的原理和技巧 创造酶切位点方法可用于内切酶价格昂贵或者无内切酶识别的情况，另外可通过错配碱基消除酶切位点、发夹结构和引物二聚体，或者与序列中其他位点的无关错配情况。

［1］王威，夏昭林.人类基因组单核苷酸多态性研究与疾病三级预防体系［J］.国外医学卫生学分册，2006，33(6):321-325.

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［3］王威，缪文彬，仇玉兰，等.双创造酶切位点PCR-RFLP检测MGMT基因多态性的应用［J］.卫生研究，2008，37(1):5-8.

［4］焦洁，王威，刘静，等.应用创造酶切位点PCR-RFLP检测乙醇脱氢酶2基因多态性［J］.卫生研究，2009，38(1):4-6.

［5］王威，杨永利，周舫，等.创造酶切位点PCR-RFLP检测MTHFR(rs2274976)基因多态性［J］.卫生研究，2011，40(2):162-163.

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