张 萌，张陶然，周俊飞，安玉会

(郑州大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室 河南郑州 450052)

Calvo报告，在美国处于骨质疏松高风险的妇女血中，由于磷酸钙分解，血磷水平增加［1］。因此认为骨质疏松病是骨的磷灰石结晶(磷酸钙)不断分解，造成血内存在高磷低钙所致状况，而且血钙从尿液排出增加［2］。这一发现无疑为骨质疏松病的防治提供了新的防治战略。本课题申请者从骨中寻找到一种骨蛋白［3］。它能有效地降低骨质疏松病模型大鼠的血磷水平和增加其骨密度［4］。这为骨质疏松病的干预和防治提供了新的技术手段。本文报告骨蛋白对骨质疏松病模型大鼠的尿钙和尿磷水平的影响。

1 材料和方法

1.1 大鼠地塞米松骨质疏松模型的建立 根据王义生等［5］报告的方法建立骨质疏松病大鼠模型。选用60只Wistar大鼠，体重(200±20)g，雌、雄各半，随机分为6组，即正常对照组(A组)、生理盐水组(B组)、阳性对照组(C组)、200 mg/kg骨蛋白组(D组)、100 mg/kg骨蛋白组(E组)，50 mg/kg骨蛋白组(F组)，除正常对照组每天每只大鼠灌胃给予2.5 ml生理盐水外，其它各组每只大鼠按2.5 mg/kg肌肉注射地塞米松，2次/周，连续注射6周造成骨质疏松模型。之后，除A和B组每天每只大鼠灌胃给予5 ml生理盐水外，C组按300 mg/kg每天每只大鼠灌胃给予接骨七厘片，D、E、F组分别每天每只大鼠灌胃给予200 mg/kg，100 mg/kg，50 mg/kg的猪骨蛋白。12周后，取尿测尿钙尿磷和羟脯氨酸含量。

1.2 尿钙含量测定 尿钙含量的测定按照钙试剂盒法测定(试剂盒由北京中生北控生物科技股份有限公司生产)。其测定原理是:在碱性条件下，样品中的钙离子与邻甲酚酞络合酮生成红色络合物。其操作步骤是:将试剂l(乙醇胺缓冲液)与试剂2(邻甲酚酞络合酮 0.175 mmol/L，8-羟基喹啉 7.80 mmol/L)等体积混合。钙标准液:2.5 mmol/L，波长:600 nm，温度:37℃，比色杯:1 cm直径。按操作程序加入不同试剂后混匀，保温5 min，读取吸光度(A)。计算公式是:钙含量(mmol/ml)=(A样品/A标准)×2.5 mmol/L(线性上限3.75 mmol/L)。

1.3 尿磷水平测定 尿磷含量测定按照磷试剂盒法测定(试剂盒由北京中生北控生物科技股份有限公司生产)。其测定原理是:在酸性条件下钼酸铵和血清中的磷反应，反应生成的未还原磷钼酸盐复合物与样本中磷的含量成正比。操作步骤是:将试剂l(硫酸23.8 mmol/L，钼酸铵1.06 mmol/L)13 ml与试剂2(吐温－80)0.5 ml混合均匀。无机磷标准液1.29 mmol/L。波长:340 nm，比色杯:1 cm直径，温度:37℃。按操作程序加入不同试剂后混匀，保温10 min，读取吸光度(A)。计算公式是:钙含量(mmoL/ml)=(A样品/A标准)×1.29 mmol/L(线性上限5.0 mmol/L)。

1.4 尿羟脯氨酸含量测定 尿羟脯氨酸含量测定按照试剂盒法测定(试剂盒由南京建成生物工程研究所生产)。其测定原理是:羟脯氨酸在氧化剂的作用下所产生的氧化产物与二甲氨基苯甲醛作用呈现紫红色，根据其呈色的深浅可推算其含量。其操作步骤是:将试剂盒中试剂(l～3)按要求配制好待用。将羟脯氨酸标准品用蒸馏水配制成5 μg/ml标准应用液。样本水解:取1 ml尿液准确加水解液l ml，混匀。放试管中加盖后，沸水浴水解20 min。将各试管流水冷却后各管加指示剂1滴，摇匀。各管准确加入调pH甲液1.0 ml，混匀(此时溶液应为红色)。各管再逐滴加调pH的乙液，直至溶液颜色变成黄绿色。此时pH值在6.0～6.8左右。然后加蒸馏水至10 ml，混匀。取3～4 ml稀释的水解液加适量活性炭，混匀，3 500 r/min离心10 min，小心取上清1 ml作检测。按试剂盒的操作程序加好试剂后混匀，60℃水浴15 min，冷却后，3 500 r/min离心10 min，取上清液在550 nm处，蒸馏水调零，测定各管吸光度。计算公式是:羟脯氨酸含量(μg/ml)=(测定管吸光度－空白管吸光度)×标准管含量×水解液总体积/(测定管吸光度－空白管吸光度)×取样量。

1.5 数据统计处理 数据统计处理采用SPSS13.0统计软件进行处理。数据以(s)表示。多样本均数比较采用单因素方差分析。两两比较采用t检验，检验水准 α =0.05。

2 结果

2.1 碱性磷酸酶和骨钙素水平的测定结果 见表1。

表1 大鼠尿钙尿磷和尿羟脯氨酸测定结果(mmol/L，s)

表1 大鼠尿钙尿磷和尿羟脯氨酸测定结果(mmol/L，s)

注:* ，与正常对照组比 P＜0.05;#，，与模型组比 P＜0.05 。

4.95 ±1.62 1.55 ±0.29 5.75 ±1.44模型组(B)6.58 ±1.61* 1.74 ±0.29* 7.28 ±1.35＊＊阳性对照组(C)4.78 ±1.55# 1.52 ±0.30 6.26 ±1.43 200 mg组(D)4.79 ±1.22# 1.65 ±0.28 5.97 ±1.11#100 mg组(E)5.00 ±1.03# 1.72 ±0.27 6.73 ±1.19 50 mg组(F)Ca P HP正常对照组(A)组别6.13 ±1.32 1.62 ±0.29 6.57 ±1.24

3 讨论

骨质疏松病是以骨密度和骨强度降低，骨脆性增加，易引起骨折，手脚腿抽筋，疼痛的骨衰老性疾病［6］。全球约有2亿人患有骨质疏松病［7］。中国约有9千万人患此病［8］。本文作者在先前的研究中已经从骨中分离出了1种骨蛋白［3］。用骨蛋白对骨质疏松病模型大鼠的干预防治研究证明，骨蛋白能有效地降低骨质疏松病模型大鼠的血磷水平并增加其骨密度［4］，这对于骨质疏松病的干预和防治提供了新的技术手段。本实验显示，骨蛋白能降低骨质疏松病模型大鼠的尿钙水平。这表明当患骨质疏松病时，骨(磷酸钙)不断分解，造成血磷升高。同时，血钙排入尿液，尿钙含量增加。骨蛋白能降低血磷水平，但不降低尿磷水平，表明骨蛋白可将血磷带入骨组织，并与钙形成磷酸钙(骨)，增加骨密度。Calvo报告，在美国处于骨质疏松高风险的妇女血中，由于磷酸钙分解，血磷水平增加，骨密度降低［1］。这说明降低骨质疏松病患者血磷水平和减少尿钙排出是防治骨质疏松病的最关键性环节之一。在妇女中，随着年龄的增加，雌激素分泌逐步减少，使骨的丢失加快，从而引起骨质疏松病。雌激素分泌逐步减少可能是妇女患骨质疏松病的主要原因。而在老年人身上，骨丢失使其体重丢失明显［9］。主要原因是25-OH VD和钙的摄入量不足。可见25-OH VD和钙的摄入量不足是引起骨质疏松病的又一关键性因素［10］。25-OH VD和钙供给不足以及女性雌激素水平的下降，会引起钙吸收和钙转运减少，就会导致骨密度降低和骨质疏松病的发生和发展。因此，补充25-OH VD和钙，补充骨蛋白和补充植物雌激素可能会获得更加有效的综合防治效果。

［1］Calvo MS.The effects of high phosphorus intake on calcium homeostasis［J］.Adv Nutr Res，1994，9:183-207.

［2］Larroche M，Ariet J，Ader JL，et al.Skeletal manifestations of moderate phosphate diabetes［J］.Clin Rheumatol，1993，12(2):192-197.

［3］安玉会，杨松华，晋佳路，等.猪骨蛋白的氨基酸含量分析［J］.河南医学研究，2004，13(3):208-209.

［4］安玉会，贺司宇，宋丹，等.猪骨蛋白对骨质疏松模型大鼠血磷水平和骨密度的影响［J］.中国组织工程研究与临床康复，2010，14(3):6253-6257.

［5］王义生，胡新永，李月白.糖皮质激素性骨质疏松症的发病机制和预防实验研究［J］.河南医学研究，2006，15(3):193-204.

［6］Lane NE.Epidemiology，etiology，and diagnosis of osteoporosis［J］.Am J Obstet Gynecol，2006，194(2suppl):S3-11.

［7］Tarantino U，Cannata G，Lecc D，et al.Incidence of fragility fractures［J］.Aging Clin Exp Res，2007，3(2):110-123.

［8］施法兴.骨质疏松症的诊断和治疗［J］.江苏临床医学杂志，2000，4(1):41-43.

［9］Ensrud KE，Lewis CE，Lambert LC，et al.Endogenous sex steroids，weight change and rates of hip bone loss in older men:the MrOS study［J］.Osteoporosis Int，2006，17(9):1329-1336.

［10］Delappe E，McGreevy C，Chadhain N，et al.Vitamin D insufficiency in older female community-dwelling acute hospital admissions and the response to supplemention［J］.Eur J Clin Nutri，2006，60(8):1009-1015.