孟津 金海红 姜丽 陈燕

子宫内膜异位症(endometriosis，EMs)是育龄女性常见病之一。主要症状包括痛经、慢性盆腔痛和不孕等。近年来发病率日益上升，其高复发率始终困扰着妇产科医生和广大患者。Ems的发病机制尚不明确。STAT3是STAT家族的重要成员，STAT3的组成性激活普遍存在于人类肿瘤中，并广泛参与肿瘤的侵袭转移、血管发生、凋亡抵抗和免疫逃避等过程。而凋亡、血管发生、黏附侵袭和免疫正是当前Ems发病机制的研究热点，被证实与子宫内膜异位症的发生发展密切相关。Ems类似恶性肿瘤的生物学行为可能正是通过STAT3通路来实现的。本实验采用免疫组织化学SP法检测P-STAT3(STAT3的活化形式)在子宫内膜异位组织和正常子宫内膜中的表达，探讨PSTAT3在子宫内膜异位症发病中的作用，以期为子宫内膜异位症的早期诊断和治疗开拓新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料 研究组:选取秦皇岛市第一医院妇科2008年1月至2011年1月经手术和病理证实的Ems患者40例的在位内膜和异位内膜组织标本(增殖期23例，分泌期17例)，患者年龄23～46岁，平均年龄(38±5)岁;平均体重指数(23.2±2.4)kg/m2。对照组:正常子宫内膜组织40例(增殖期25例，分泌期15例)，年龄27～49岁，平均年龄(38±5)岁;平均体重指数(22.9±2.5)kg/m2。2组间年龄和体重指数差异无统计学意义(P＞0.05)。2组患者月经规律，除外妊娠、哺乳期女性及其他妇科合并症，无内外科合并症及恶性肿瘤，术前6个月内未接受激素治疗。

1.2 方法

1.2.1 试验试剂:一抗为兔抗人P-STAT3多克隆抗体(美国CST公司)。即用型快速免疫组化MaxVisionTM检测试剂盒和DAB显色剂(福州迈新生物技术有限公司)。PBS缓冲液和橘橼酸盐缓冲液为自配。

1.2.2 检测方法:所有标本经甲醛固定后常规石蜡包埋，制成4 μm厚连续切片。切片常规脱蜡、脱苯、封闭内源性过氧化物酶、抗原修复。依照SP试剂盒说明书操作。中性树胶封片后显微镜下观察，并用PBS液代替一抗作为阴性对照。

1.2.3 结果判断:以子宫内膜腺上皮细胞的细胞核着色为阳性细胞，参照Fromowitz等［1］的半定量积分法，以染色强度和染色范围对实验结果进行判定。染色强度分为:不染色计0分;弱染色(淡黄色)计1分;中等染色(黄色)计2分，强染色(棕黄色)计3分。染色范围:随机选取10个具有代表性的高倍镜视野(×400)，每视野计数100个腺上皮细胞，按照阳性细胞百分率分为:阳性细胞0～5%计0分，阳性细胞6% ～25%计1分，阳性细胞26% ～50%计2分，阳性细胞51% ～75%计3分，阳性细胞＞75%计3分。每张切片的两分数相加计算总分:0～2分为阴性(－)，3分为弱阳性(+)，4分为阳性(++)，5～7分为强阳性(+++)。

1.3 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，采用非参数Wilcoxon W检验、McNemar检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

P-STAT3在对照组子宫内膜组织与研究组在位和异位内膜组织中均主要表达在腺上皮细胞的细胞核，间质也有少量表达(图1～3)。

2.1 P-STAT3在对照组子宫内膜的表达

2.1.1 表达强度:P-STAT3在对照组子宫内膜中呈弱表达，在25例增殖期中仅有1例阳性表达，在15例分泌期中有5例阳性表达，表达强度为(－)至(+)。

2.1.2 增殖期与分泌期的表达比较l:P-STAT3在对照组子宫内膜的表达强度分泌期高于增殖期，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表 1。

2.2 P-STAT3在研究组在位内膜中的表达

2.2.1 组间的表达比较 P-STAT3在研究组在位内膜中的表达强度高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

2.2.2 组间增殖期的表达比较:P-STAT3在研究组在位内膜中的表达强度高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

图1 P-STAT3在对照组子宫内膜的阳性表达(SP×400)

图2 P-STAT3在研究组在位内膜的阳性表达(SP×400)

图3 P-STAT3在研究组异位内膜的阳性表达(SP×400)

2.2.3 组间分泌期的表达比较:P-STAT3在研究组在位内膜中的表达强度高于对照组，差异有统计学意义(P=0.05)。见表1。

2.2.4 增殖期与分泌期的表达比较:P-STAT3在研究组在位内膜中的表达强度增殖期与分泌期比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

2.3 P-STAT3在研究组异位内膜中的表达

2.3.1 增殖期与分泌期的表达比较:P-STAT3在研究组异位内膜组织中的表达强度增殖期与分泌期比较差异无统计学意义(P ＞0.05)。见表1。

2.3.2 组间的表达比较:P-STAT3在研究组异位内膜中的表达强度高于研究组在位内膜和对照组子宫内膜，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1、2。

2.3.3 组间增殖期的表达比较:P-STAT3在研究组异位内膜中的表达强度高于研究组在位内膜和对照组子宫内膜，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1、3。

2.3.4 组间分泌期的表达比较:P-STAT3在研究组异位内膜中的表达强度高于研究组在位内膜和对照组子宫内膜，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1、4。

表1 P-STAT3在不同子宫内膜中的表达 例

表2 P-STAT3在研究组异位内膜和在位内膜中的表达 n=40，例

表3 P-STAT3在增殖期病例组异位内膜与在位内膜中的表达 n=23，例

表4 P-STAT3在分泌期研究组异位内膜和在位内膜中的表达 n=17，例

3 讨论

子宫内膜异位症是指子宫内膜基质或上皮细胞在子宫体以外部位附着生长。近年来发病率逐步上升，国外在育龄妇女的妇科腹腔镜术中研究发现，EMs病变已达45%［1］。EMs具有组织侵袭、局部播散、复发转移等类似恶性肿瘤的生物学行为，临床采用手术、药物等多种治疗方法，但效果并不满意，复发率高。子宫内膜异位症的病因及发病机制至今不明，主要有子宫内膜种植学说、诱导学说、体腔上皮化生学说等。但均未能对Ems的发病机制做出完满解释。

子宫内膜异位症表现类似恶性肿瘤的生物学行为，及其与卵巢癌的关联［2］，提示EMs与肿瘤间存在潜在联系。STAT3广泛存在人体多个组织，是JAK、EGFR、Src等多个致癌性酪氨酸激酶信号通路的汇集点，在多种类肿瘤细胞中存在STAT3过度激活，与肿瘤的异常增生、侵袭转移、凋亡抵抗、血管发生和免疫抑制等密切相关。

STAT3通路是多种凋亡调节基因的上游基因，可能通过调节Ems的凋亡参与EMs的发病。对肿瘤的研究证实，伴随STAT3的激活发生系列凋亡相关基因的改变及调亡的抑制［3］。而抗凋亡因子 Bcl-2、Survivin和促凋亡因子 Bax、Fas，C-myc、P53等通过改变Ems患者的异位内膜、腹腔环境等的凋亡而参与EMs的发生发展。EMs类似恶性肿瘤的凋亡抵抗、血管形成、侵袭种植等生物学行为及相对较高的恶变率可能都与凋亡异常有关。巨噬细胞诱导异位至腹腔的内膜细胞凋亡的能力下降和异位细胞抗凋亡能力上升是Ems的发病基础［4］。本次研究提示EMs异位内膜组织中存在P-STAT3的高表达及周期性变化丧失，这与Harada等［5］的研究中发现异位内膜的调亡敏感性下降及失去周期性变化的结果相呼。

通过调节血管生成相关因子调控血管生成，可能是STAT3促进Ems发病的机制之一。子宫内膜异位病灶在腹腔种植后需要新生血管提供营养支持，所以血管生成对Ems的发生发展至关重要。Nap等［6］发现血管生成抑制剂能够显著减少裸鼠的微血管密度和异位病灶数量，证明抑制血管发生可妨碍子宫内膜异位病灶的维持和发展。STAT3作为重要的多功能诱导因子，于转录水平调节血管发生的各个方面。血管内皮生长因子(VEGF)是最重要的促血管生成因子。STAT3能够直接诱导激活VEGF基因，还能够诱导缺氧诱导性因子1α(HIF-1α)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等促血管生成因子的表达。

调控基质金属蛋白酶(MMPs)的活性而参与EMs的侵袭，是STAT3引发Ems的又一可能机制。MMPs是降解细胞外基质的重要酶类。Osteen等［7］提出，MMPs调节系统的改变促进Ems的子宫内膜脱落，对异位内膜细胞在腹腔的生长和侵袭发挥关键作用。Laudanski等［8］发现腹腔内环境中MMPs表达异常导致蛋白溶解能力紊乱，这也与Ems发病有关。而STAT3通路正是通过调控MMPs的活性促进细胞外基质的降解、调节肿瘤细胞黏附，参与肿瘤的侵袭转移。

STAT3作为免疫逃避调节的关键点，可能促成内异症的发生发展。内异症与免疫因素的关系极为密切。正常情况下腹腔液中存在能够维持腹腔内环境稳定的腹膜清除系统。而STAT3能够抑制免疫刺激因子和刺激免疫抑制因子的表达，调节肿瘤的免疫逃避。异位内膜细胞中STAT3的高表达可能调节异位内膜细胞的免疫逃避，降低腹腔内环境对异位内膜细胞的清除能力，从而促进Ems的发生发展。

STAT3通过酪氨酸残基或丝氨酸残基的磷酸化而被激活。本次实验采用免疫组化SP法检验激活状态的STAT3(PSTAT3)在EMs患者的异位内膜组织中的表达。结果显示，PSTAT3在Ems异位内膜组织中的表达强度显著高于正常子宫内膜。而且，在月经周期的不同时相中，P-STAT3在Ems异位内膜组织中的表达强度均高于同期正常子宫内膜。Ems的异位内膜组织中存在P-STAT3的异常表达，这可能正是子宫内膜异位症的发病原因。

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5 Harada T，Kaponis A，Iwabe T，et al.Apoptosis in human endometrium and endometriosis.Hum Reprod Update，2004，10:29-38.

6 Nap AW，Griffion AW，Dunselmang A，et al.Anti-angiogenesis therapy for endomet-riosis.J Clin Endocrinol Metab，2004，89:1089-1095.

7 Osteen KG，Bruner-Tran KL，Keller NR，et al.Progesterone-mediated endometrial maturation limits matrix metalloproteinase(MMP)expression in an inflammatory-like environment:a regulatory system altered in endometriosis.Ann N Y Acad Sci，2002，955:37-47.

8 Laudanski P，Szamatowicz J，Ramel P.Matrix metalloproteinase-13 and membrane type-1 matrix metalloproteinase in peritoneal fluid of women with endometriosis.Gynecol Endocrinol，2005，21:106-110.