齐战 杨大运 刑亚威 刘俊霞 张月花

非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌的75%以上，是全球范围内引起癌症死亡的主要原因，侵袭、转移及复发是肺癌临床治疗的难点，而其机制尚不清楚，因此研究肺癌侵袭、转移的发生机制及探讨新的可行的治疗方案具有极其重要的临床意义。Raf激酶抑制蛋白(raf kinase inhibitor protein，RKIP)属于高度保守的磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidyl ethanolamine binding protein，PEBP)家族，广泛存在于多种生物中。RKIP参与Raf-MEK1/2-ERK1/2、G蛋白、NF-κB等多条信号传导通路的调节，还通过抑制G蛋白藕联受体激酶-2(GPCR-2)来发挥受体信号调节器的作用。RKIP在细胞信号调控网络中的作用受到了人们的广泛关注，特别是发现RKIP具有抑制肿瘤细胞转移的作用，被认为是肿瘤转移抑制基因。但RKIP在肺癌中的研究报道较少。本研究运用免疫组织化学检测RKIP在肺癌及正常肺组织中的表达，分析RKIP与肺癌临床病理学特征的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集河北医科大学第四医院确诊为原发性支气管肺癌手术切除标本83例，取癌组织中心为癌组织，与癌组织相距最远处为正常肺组织，标本65例。所有病例均经病理证实，患者术前未接受过放、化疗。标本用10%的甲醛固定，石蜡包埋。癌组织:男48例，女35例;年龄33～75岁，平均年龄53.7岁。按照 AJCC和UICC分期标准:鳞癌36例，腺癌47例;高分化25例、中分化23例、低分化35例;Ⅰ+Ⅱ期38例，Ⅲ+Ⅳ期45例;根据有无淋巴结转移分为淋巴结转移阳性43例，阴性40例。其中80例有完整随访资料，随访截止日期为2011年1月，生存期的计算从手术日期到随访截止日期，或由于复发、转移而死亡的日期为止。

1.2 方法 主要试剂:山羊抗人RKIP多克隆抗体(Santa Cruz公司，美国)，过氧化物酶标记的链霉卵白素(SP)试剂盒(北京中衫金桥生物技术公司)。免疫组织化学染色:对石蜡切片进行免疫组化链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(streptavidin-perioxidase，S-P)法测定。免疫组织化学染色程序按试剂盒说明书进行，主要包括石蜡切片、常规脱蜡至水，抗原修复、3%H2O2阻断内源性过氧化物酶、山羊血清封闭、滴加一抗、二抗及链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物、DAB显色、对比染色封片。同时设阳性和阴性对照:阳性对照为试剂公司提供的强阳性标本切片，阴性对照采用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗。用光学显微镜观察免疫组织化学染色的切片，选取5个具有代表的高倍镜视野，计数阳性细胞数占总细胞数的百分比，取算术平均值。RKIP蛋白表达强度根据阳性物质的着色深浅及面积判断。评分标准按照Shumizu方法。对每张切片阳性细胞数的阳性强度按无着色、淡黄色、棕黄色和棕褐色分别记0、1、2、3分，着色阳性面积按无着色、着色＜1/3、1/3～ 2/3、＞2/3 分别记0、1、2、3 分，然后根据2项记分之和判断其结果:＞3分为阳性。

1.3 统计学分析 应用SPSS 10.0统计软件，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RKIP蛋白在正常肺组织与NSCLC癌组织中的表达 83例肺癌组织中，66例表达阴性或少数微弱表达，仅17例呈高表达，阳性表达率20.5%(17/83)，RKIP蛋白的阳性表达在高倍镜下呈棕黄色颗粒，主要位于肿瘤细胞的胞质，多呈弱阳性和阴性，基质表达较少。65例癌旁正常肺组织中，23例表达阴性或少数微弱表达，42例呈阳性表达，阳性表达率64.6%(42/65)。肺癌组织中RKIP的表达与正常肺组织中的表达比较(χ2=29.617)，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 肺癌、正常肺组织中RKIP蛋白表达结果 例(%)

2.2 RKIP与临床病理特征的关系 RKIP蛋白的阳性表达与肿瘤瘤体大小、性别以及大量吸烟史无统计学意义(P＞0.05)。肺癌高分化者RKIP蛋白阳性表达率高于低分化者(P＜0.05)，肺癌中RKIP阳性表达率随着临床TNM分期增加而下降，分期越晚表达率越低，各期间RKIP的阳性率差异有统计学意义(P＜0.05)，术后生存期＜2年者RKIP阳性表达率明显低于≥2年者(P＜0.05)，肺癌淋巴结转移者RKIP阳性表达明显低于非转移者(P＜0.05)。见表2。

表2 RKIP蛋白表达情况与临床病理特征的关系 例(%)

3 讨论

肿瘤转移是基因调控下的多阶段、多因素、多步骤过程，通过肿瘤转移相关基因的过度表达或下调，以及一系列基因产物的参与，对肿瘤转移的整个过程进行调控。侵袭转移是恶性肿瘤最重要的生物学行为，控制肿瘤侵袭、转移及复发一直是肿瘤研究的热点之一。因此，发现并证实与肿瘤转移高度相关的基因，阻断信号传导通路将成为癌症治疗新策略。研究发现，生长因子的细胞内信号转导通路同肿瘤转移密切相关［1］。

RKIP是一个高度保守、广泛表达的小分子胞浆蛋白，调节许多重要的生理功能如心脏和神经功能，精子发生和生殖行为［1］。RKIP能抑制乳癌、前列腺癌、结直肠癌、胃癌等多种恶性肿瘤转移，其机制可能与抑制Ra-/MEK/ERK或NF-κB信号转导途径有关。RKIP的表达水平不仅与人类多种肿瘤的转移能力呈负相关，而且与肿瘤预后相关。RKIP表达下调/缺失的患者预后差。

Li等［2］应用免疫组化方法检测原发性乳腺癌及乳腺转移癌中RKIP的表达，结果发现，RKIP蛋白表达主要在细胞浆，部分在细胞核，在正常或良性乳腺上皮细胞中表达率高，而侵袭性癌的表达明显减少。在淋巴结阳性的原发肿瘤中，RKIP阳性表达率为31.58%，而相对应的来自于同一标本的转移淋巴结，RKIP的阳性表达率为10.53%，研究显示RKIP的表达在转移癌中明显减少或缺失。结果表明，RKIP的是人类乳腺癌转移抑制基因。Fu等［3］对原发性与转移性前列腺癌和非癌性前列腺组织的组织芯片进行RKIP免疫组化染色，发现在转移性前列腺癌中RKIP的表达明显下降。原发癌中高水平表达RKIP的患者7年复发率＜10%，而低水平表达RKIP的患者复发率为50%，RKIP低表达是前列腺癌复发的强阳性预后因子，多变量分析表明RKIP是一种独立的预后因子，RKIP可作为前列腺癌的1个新的诊断标志物 。Al-Mulla等［4］应用免疫组化方法检测结直肠癌标本，结果发现79例有淋巴结转移的结直肠癌标本中仅12例RKIP阳性表达，RKIP的表达只与淋巴结转移有关，与性别、年龄、肿瘤部位及Duke’s分期无关，随访结果显示:RKIP阳性表达组中位生存期长，说明RKIP表达与结直肠癌患者预后有关;Wang等［5］应用免疫组化方法检测RKIP在非肿瘤性胃组织，胃癌组织中的表达和评价其在胃癌发生及转移中的作用。结果显示:40例非肿瘤性胃组织中，RKIP表达阳性率为87.5%，75例胃癌组织中，RKIP表达阳性率为52%，26例转移淋巴结组织标本中，RKIP表达阳性率为19.2%，RKIP在非肿瘤性胃组织中高表达，在转移性胃癌组织中低表达，表明RKIP在胃癌侵袭转移中的发挥作用。韩海勃等［6］在mRNA和蛋白水平分别检测了多个人肺癌细胞系RKIP表达，结果显示，存在转移性的A549、PG、Calu6细胞系中RKIP表达量呈显著的下调趋势，且转移性较高的A549细胞系下调最明显。提示RKIP的低表达与肺癌的侵袭、转移有关。

RKIP是一个潜在的肿瘤转移抑制蛋白，然而，RKIP在肺癌中的作用报道较少。本研究应用免疫组化方法研究肺癌和癌旁正常肺组织中RKIP的表达，评估它在肺癌生成和转移中的作用，本研究结果显示:癌旁正常肺组织RKIP高表达率64.6%，肺癌中RKIP高表达率20.5%，有淋巴结转移的肺癌组织RKIP高表达率11.6%，RKIP低表达率30.0%，RKIP低表达与肺癌的分化程度、临床分期，淋巴结转移及生存期有关，RKIP的表达水平随着肺癌淋巴结转移的发展而呈现下调的趋势，提示RKIP表达下调与肺癌组织的恶性程度有关，且RKIP低表达者生存期短。说明RKIP在抑制肺癌发生发展、侵袭转移过程中发挥重要作用。

1 Keller ET，Fu Z，Brennan M.The role of Raf kinase inhibitor protein(RKIP)in health and disease.Biochem Pharmacol，2004，68:1049-1053.

2 Li HZ，Gao Y，Zhao XL，et al.Effects of Raf kinase inhibitor protein expression on metastasis and progression of human breast cancer.Mol Cancer Res，2009，7:832-840.

3 Fu Z，Kitagawa Y，Keller ET，et al.Metastasis suppressor gene Raf kinase inhibitor protein(RKIP)is a novel prognostic marker in prostate cancer.Prostate，2006，66:248-256.

4 Al-Mulla F，Hagan S，Behbehani AI，et al.Raf kinase inhibitor protein expression in a survival analysis of colorectal cancer patients.J Clin Oncol，2006，24:5672-5679.

5 Wang J，Yang YH，Wang AQ，et al.Immunohistochemical detection of the Raf kinase inhibitor protein in nonneoplastic gastric tissue and gastric cancer tissue.Med Oncol，2010，27，2:219-223.

6 韩海勃，张志谦，赵威.RKIP蛋白在多个人肺癌细胞系中的表达下调.基础医学与临床，2007，27:849-852.