杨峥莉 赵 扬 刘荣霞 张 霞

河北省石家庄市第四医院妇产科 050011

宫颈癌是全球妇女中仅次于乳腺癌的第二个常见的恶性肿瘤,其发病是多种因素作用导致多基因改变的结果。近年来发现肿瘤发生除与细胞过度增殖有关外,细胞凋亡的抑制也参与了宫颈癌的发生、发展。Bcl-2、Survivin、Fas是重要的细胞凋亡调节基因,它们不仅对维持细胞的正常生理功能与生存繁殖有着重要意义,而且在许多自身免疫性疾病及某些肿瘤的病理发生中具有重要作用。笔者应用免疫组织化学方法检测Bcl-2、Survivin、Fas在正常宫颈、CIN、宫颈癌中的表达,揭示三者在宫颈癌的发展过程中的临床意义,为宫颈癌的发生、发展的机制提供理论依据,为宫颈癌的预防和治疗提供监测指标。

1 材料与方法

1.1 材料 所有标本为我院2000年1月-2007年4月间存档石蜡标本共195份,其中正常子宫颈组织(来源于因子宫肌瘤或卵巢肿瘤行子宫全切的宫颈组织)30份,CINⅠ42份,CINⅡ38份,CINⅢ45份,宫颈浸润鳞癌40份。患者术前均未接受化疗、放疗和性激素治疗。年龄38～77岁,平均年龄52.6岁。

1.2 方法 所有标本均经10%甲醛固定,石蜡包埋,4μ m连续切片,HE染色,光镜观察。免疫组化采用SP法,鼠抗人Bcl-2单克隆抗体试剂盒、兔抗人Survivin多克隆抗体试剂盒、兔抗人Fas多克隆抗体试剂盒、SP(鼠/兔)免疫组化试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。实验步骤均按试剂盒说明书进行。光学显微镜下观察,细胞浆和/或细胞膜呈棕黄色者为Bcl-2、Survivin、Fas阳性细胞。每例随机计数200个细胞,计算其阳性细胞比率(%)记分:1～25为1分,26～50为2分,51～75为3分,76～100为4分;染色程度记分:淡黄为1分,棕黄为2分,棕褐为3分。评定结果:阳性细胞比率+染色程度总分数,阴性0～3分,阳性4～7分。

1.3 统计学处理 采用SPSS11.5软件进行统计学处理,各样本率差异的比较采用χ2检验,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 Bcl-2、Survivin及Fas在正常宫颈上皮、CIN和宫颈癌中的表达情况 Bcl-2及Survivin阳性染色均主要定位于细胞浆,Fas表达阳性染色主要定位于肿瘤细胞胞质和胞膜中,呈淡黄色或棕黄色颗粒。正常宫颈上皮,Bcl-2、Fas有表达而Survivin无表达。Bcl-2、Survivin及Fas在CIN和宫颈癌中均有不同程度的表达,Bcl-2及Survivin在CIN中的阳性表达率显著高于正常宫颈上皮(P＜0.05),在宫颈癌的阳性表达率显著高于CIN组(P＜0.05)。而Fas在正常宫颈中的阳性表达高于CIN和宫颈癌组,差异均有统计学意义(P＜0.05);CIN与宫颈癌组差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

2.2 Bcl-2、Survivin及Fas在CIN各期组织中的表达 在CIN组织中,随着宫颈上皮内瘤样病变的进展(CINⅠ～Ⅲ),Bcl-2表达阳性率分别为21.4%、31.6%和60.0%,CINⅠ、CINⅡ和 CINⅢ组间两两比较差异有统计学意义(P＜0.05);Survivin阳性率分别为23.8%、57.9%和86.7%,CINⅠ、CINⅡ和CINⅢ组两两相比差异有统计学意义(P＜0.05);Fas表达阳性率,分别为 76.19%、44.70%和40.0%,CINⅠ分别与CINⅡ、CINⅢ组比较差异有统计学意义(P＜0.05),而CINⅡ与CINⅢ组间比较无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 Bc1-2、Survivin、Fas蛋白在正常宫颈、CIN及宫颈癌中的表达〔n(%)〕

2.3 Survivin与Bcl-2、Fas的相关性 经等级相关检验发现:在宫颈病变组织中,Survivin与Bcl-2的表达呈正相关(P＜0.05);Survivin与Fas的表达呈负相关(P＜0.05)。

3 讨论

Bcl-2(B-celllymphoma/leukemia-2)为发现较早的凋亡抑制因子。Bcl-2基因定位在18q21,Bcl-2蛋白含239个氨基酸,分子量为26KD。转基因试验表明,Bcl-2基因有致癌性,其致癌机制并非通过促进细胞增殖引起,而是由于其抑制细胞凋亡造成肿瘤细胞的堆积[1]。可能的机制是通过封闭细胞核转运,抑制细胞内钙离子浓度升高,发挥抗氧化作用和抗凋亡作用。研究证实多种肿瘤组织中存在Bcl-2的过度表达[2～4],Bcl-2基因表达异常增加可使已有基因异常改变的细胞逃避凋亡,由此引起的基因异常事件的累积是导致细胞转化和肿瘤形成的必要前提[5]。本研究采用免疫组化技术对正常宫颈、宫颈上皮内瘤变组织和宫颈癌组织中的Bcl-2蛋白表达进行检测,发现Bcl-2蛋白在正常宫颈、CIN和宫颈癌组织中的阳性率逐渐增加,同时随着CIN病变加重而逐渐升高,差异有统计学意义(P＜0.05)。提示Bcl-2蛋白过度表达与宫颈癌的发生有关,在宫颈癌变的早期阶段,各种致癌因子如高危型HPV感染,引发细胞内Bcl-2基因活化,导致其基因产物的过度表达,Bcl-2通过抑制细胞凋亡,延长细胞寿命使遗传物质突变率增加,从而增加肿瘤发生的机会。因此在临床工作中,对Bcl-2阳性的患者一定要注意其病变的进展,给予适当的处理。

Survivin基因位于人类17号染色体q25区,属于凋亡抑制蛋白家族(IAP),是IAP家族中迄今发现最强的凋亡抑制因子。具有抑制细胞凋亡和调节细胞有丝分裂的双重功能,是联系细胞周期和细胞凋亡界面的重要因子。在生理状态下,凋亡途径清除体内衰老和异常的细胞,有利于保持体内组织的动态平衡。在肿瘤发生的早期,Survivin过表达直接或间接抑制了凋亡,利于异常基因的进一步积聚,促使细胞恶性转化,从而有助于肿瘤的进展。Branca等[6]研究表明Survivin是一种早期宫颈癌发生的标志,Survivin的抗凋亡功能是通过人乳头状瘤病毒(HPV)E6阻断野生型P53的正常转录实现的。

Survivin是肿瘤特异性凋亡抑制因子,在几乎人类所有的肿瘤中高表达[7]。Kim等[8]通过免疫组化的方法对41例CIN及宫颈浸润癌的研究发现,随着病变的发展,Survivin的表达逐渐升高。本研究结果在30例正常子宫颈组织中,Survivin表达均为阴性。在子宫颈上皮内瘤样变中检测到了Survivin的表达,而且随子宫颈上皮内病变的进展,从正常子宫颈发展到CINⅠ、CINⅡ,再到CINⅢ,浸润癌,Survivin的表达率逐渐升高,差异有统计学意义(P＜0.05),提示Survivin作为凋亡抑制蛋白在子宫颈从癌前病变到癌的演变进程中扮演了重要角色。Survivin在宫颈中的过度表达,通过抑制细胞凋亡,为存在基因缺陷的细胞提供生存优势,促使基因突变的积聚和细胞恶性转化,最终导致宫颈癌发生发展。因此,临床上对于宫颈病理诊断CINⅠ～Ⅱ,同时Survivin表达阳性的病例,应严密随访并积极治疗。

Fas是一种由319个氨基酸组成的分子量为45 000的Ⅰ型跨膜糖蛋白,在多种组织中均有表达,组织细胞类型不同表达程度也不同。Fas基因位于人染色体10q23上,Fas抗原属于神经生长因子/肿瘤超家族的成员之一[9]。FasL是Fas抗原TNF家族,两者结合可导致细胞调亡[10]。免疫研究发现,正常的Fas系统能有效地去除过度激活的免疫活性细胞,从而下调免疫反应及细胞毒性淋巴细胞的功能。如果Fas或其配体FasL出现表达异常,即可逃避机体免疫细胞的攻击而不断增殖,最终形成一个实体瘤[11]。Das等[12]观察Fas在宫颈癌中的表达明显下调。杜俊瑶等[13]研究显示,Fas在正常宫颈、CIN及宫颈癌中表达差异有显著性,随肿瘤的形成有明显降低的趋势,并且与宫颈癌细胞的分化程度有关。本研究显示,Fas在正常宫颈的阳性表达率86.67%,CIN的阳性表达率53.60%,而在宫颈癌中Fas表达率为45%。Fas在正常宫颈中表达显著高于CIN及宫颈癌组(P＜0.05),CIN与宫颈癌组差异无显著性(P＞0.05)。提示Fas的异常表达可能参与宫颈癌的发生、发展。宫颈癌细胞由于某种原因而降低了Fas的表达,细胞逃逸了机体的免疫监而难以凋亡,最终导致肿瘤的发生、发展和转移。可见,Fas是免疫系统自稳的重要分子学基础,增强Fas抗原表达及活化有望成为肿瘤治疗新手段。

总之,宫颈癌的发生是多基因损伤的复杂过程,它的发生、发展与凋亡相关基因的异常表达、癌基因激活、抑癌基因的突变等有关。Bcl-2及Survivin在宫颈组织中的过表达及Fas的表达缺失而导致的细胞凋亡与宫颈癌的发生、发展有密切关系,对宫颈癌的诊断预后具有重要参考价值。

[1] Sanz L,Garcia-Marco JA,Casanova B,et al.Bcl-2 family genemodulation during spontaneous apoptosis of B-chronic lymphocytic leukemia cells〔 J〕 .Biochem Biophys Res Commun,2004,315(3):562-567.

[2] Konturek PC,Konturek CT,Sulekova Z,et al.Expression of hepatocyte growth factor,transforming growth factor alpha,apoptosis related proteins Bax and bcl-2,and gastrin in human gastric cancer〔J〕 .Alimeat Pharmacol Ther,2001,15(7):989.

[3] 康凯夫,陈坚平,黄金凤,等.DNA-PKcs、Bcl-2、Cyclin G 在星形细胞瘤中的表达及与肿瘤分化和预后的关系〔J〕.实用癌症杂志,2006,21(2):152.

[4] 黄金凤,何志明,李炜霞,等.Bcl-2、Survivin在子宫内膜癌组织中的表达及意义〔J〕.实用癌症杂志,2007,22(1):99.

[5] Manusirivithaya S,Siriaunkgul S,Khunamornpong S,et al.Association between bcl-2 expression and tumor recurrence in cerical cancer:A matched case-control study 〔J〕.Gynecol Oncology,2006,102(2):263-269.

[6] Branca M,Giorgi M,Santini D,et al.Survivin as a marker of cervical intraepithelial neoplasia and high-risk human papillomavirus and a predictor of virus clearance and prognosis in cervical cancer〔J〕.Am J Clin Pathol,2005,124(1):113-121.

[7] Takeuchi H,Morton DL,Elashoff D,et al.Survivin expression by metastatic melanoma predicts poor disease outcome in patients receiving adjuvant polyvalent vaccine〔J〕.Int J Cancer,2005,117(6):1032-1038.

[8] Kim HS,Shiraki K,Park SH.Expression of survivin in CIN and invasive squamous cell carcinoma of uterine cervix〔J〕.Anticancer Res,2002,22(2A)∶805-808.

[9] 桑威.Fas/FasL系统参与的几种生物学效应〔J〕.国际免疫杂志,2006,11(9):389-392.

[10] Iwase M,Kondo G,Watanabe H,et al.Regulation of fas-mediated in neutrophils after surgery induced acute inflammation〔J〕.J Surg Res,2006,134(1):114-123.

[11] Zuo XL,Zhou Y,Li RF,et al.Relation of apoptosis of K562 cells induced by naringenin in vitro to enzyme activity changes of caspase-3 and caspase-8 and expression of FAS/FASL proteins〔J〕.Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi,2008,16(2):286-289.

[12] Das H,Koizumi T,Sugimoto T,et al.Quantitation of Fas and Fas ligand gene expression in human ovarian,cervical and endometrial carcinomas using real-time quantitative RT-PCR〔J〕.Br J Cancer,2000,82(10):1682-1688.

[13] 杜俊瑶,姚嘉斐,辛彦.Survivin与 Fas在宫颈不典型增生和宫颈癌中的表达及临床意义〔J〕.中国实用妇科与产科杂志,2005,21(11):672-674.