潘卫松 肖 瑛

（1.广州市药品检验所，广东广州510610；2.暨南大学药学院，广东广州510632；3.暨南大学中药药效物质基础及创新药物研究广东省高校重点实验室，广东广州510632）

橄榄油系由油橄榄的成熟核果提炼制成的脂肪油，为常用药用辅料、溶剂和分散剂。《中国药典》2010年版二部在正文品种第二部分中收录该品种，但并未对其细菌内毒素进行控制，由此限制了其在注射剂中的应用。为此，本研究参照现行中国药典收载的细菌内毒素检查法[1，2]，对精制橄榄油进行了细菌内毒素检查的方法研究，现报道如下。

1 仪器与试药

TW12六孔恒温水浴（Julabo公司）；MSI旋涡混合器（广州IKA公司）；XS204电子天平（METTLER TOLEDO公司）。

细菌内毒素工作标准品（规格：每支120EU，批号：150601－200699）由中国药品生物制品检定所提供；细菌内毒素检查用水（BET水，规格：每支50mL，批号：1007161）及鲎试剂（TAL）A（规格：每支0.1mL，批号：1005071，灵敏度：0.25EU/mL）购自湛江安度斯生物有限公司；TAL B（厦门市鲎试剂实验厂有限公司，规格：每支0.1mL，批号：100101，灵敏度：0.25EU/mL；精制橄榄油德国Lipoid GmbH公司，批号：799395，799399，799398。

2 方法与结果

2.1 细菌内毒素限值的确定

根据企业资料，本品细菌内毒素限值为3EU/g。

2.2 鲎试剂灵敏度复核试验

鲎试剂标示灵敏度（λ）的复核按照2010年版《中国药典》（二部）附录细菌内毒素检查法规定进行。结果见表1。

表1 鲎试剂灵敏度复核试验结果

由表1可见，3批鲎试剂λc均在0.5λ～2.0λ之间，符合进行细菌内毒素检查的规定。

2.3 干扰预试验[3-5]

2.3.1 最小有效稀释浓度 最小有效稀释浓度c=λ/L，L=0.1 EU/mg，用于药品检验的市售鲎试剂灵敏度一般在 0.25

～0.03EU/mL之间，故精制橄榄油进行细菌内毒素检测时，0.25～0.03EU/mL的鲎试剂相对应的最小有效稀释浓度为83.4mg/mL、41.7mg/mL、20.8mg/mL、10.4mg/mL。

2.3.2 预试验 取3批精制橄榄油，用卵磷脂溶液适量及BET水将样品稀释成83.4mg/mL、41.7mg/mL、20.8mg/mL、10.4mg/mL共4个浓度梯度的溶液，将此系列浓度溶液标记为供试品管（NPC系列）。用上述稀释液作为溶剂，溶解并稀释细菌内毒素工作标准品，制得每个稀释度中细菌内毒素含量均为2λ（0.5EU/mL和0.25EU/mL）的精制橄榄油溶液，标记此系列溶液为供试品阳性对照管（PPC系列）。取灵敏度为0.25EU/mL的两个不同厂家的鲎试剂进行试验，每一稀释度做2管，同时按常规分别设细菌内毒素阳性对照（PC）和检查用水阴性对照（NC）各2管，结果见表2。

表2 样品干扰预试验结果

从表2可见，所用的3批精制橄榄油稀释到83.4mg/mL或以下浓度的溶液时，对两个厂家的鲎试剂与细菌内毒素反应均无增强或抑制的干扰作用。

2.4 正式干扰试验

用两个厂家的鲎试剂（灵敏度为0.25EU/mL），按现行中国药典方法进行试验，测定用BET水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（Es）和用供试品稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值（Et）。取3批精制橄榄油，分别加卵磷脂溶液适量及 BET水稀释成 83.4mg/mL（批号：799395，799399，799398），用BET水和供试品稀释液将细菌内毒素工作标准品稀释成2λ、1λ、0.5λ、0.25λ浓度的BET水系列细菌内毒素溶液和供试品稀释液系列细菌内毒素溶液，每一稀释浓度重复4管，同时用上述供试品稀释液和BET水各做2管阴性对照管，按下列公式计算BET水和供试品稀释液反应终点浓度的几何平均值（Es和Et），Es=lg-1（∑Xs/4），Et=lg-1（∑Xt/4），结果见表3。

从表3结果可见，2λ管均为阳性，0.5λ、0.25λ管均为阴性，对于λ=0.25EU/mL的2组鲎试剂的Es为0.25EU/mL，Es均在0.5λ～2.0λ范围内，3批精制橄榄油测得的Et均在0.5λ～2.0λ范围内，Et和Es的比值在0.5～2.0之间，说明精制橄榄油在83.4mg/mL或以下浓度的溶液对两个不同厂家的鲎试剂与内毒素的反应无增强或抑制的干扰作用，符合现行中国药典对细菌内毒素检查有效性的规定，因此可以确定精制橄榄油的最大无干扰浓度为83.4mg/mL。

表3 样品（83.4m g/m L）干扰试验结果

2.5 样品细菌内毒素检查

取3批精制橄榄油，分别根据“2.4”项下方法制成供试品稀释液，使用λ=0.25EU/mL的两个厂家的鲎试剂进行细菌内毒素检查，并用此稀释液将细菌内毒素工作标准品稀释为2λ的溶液，作为供试品的阳性对照，另外以细菌内毒素检查用水建立阳性对照和阴性对照。按现行中国药典部细菌内毒素检查法检查，结果见表4。阴性对照管（NC）均为阴性，供试品阳性对照管（PPC）和阳性对照管（PC）均为阳性，实验成立；供试品管（NPC）均为阴性，表明样品中未检出细菌内毒素，3批精制橄榄油的细菌内毒素检查均符合规定。

表4 样品细菌内毒素检查结果

3 讨论

热原检查是肠外给药制剂及原料重要的质量控制项目。细菌内毒素检查法目前已被各国药典广泛采纳，作为替代热原检查法的体外检测方法之一应用于药品的质量控制，但该方法存在易受到各种检测因素干扰的缺点，故在中药制剂，生物制品和药用辅料的检测上还存在着不少限制。本研究探讨了细菌内毒素检查法应用于药用辅料的可行性，为提高药用辅料的质量标准进行了初步的探索[6-8]。

不同厂家的鲎试剂由于生产工艺，质量参数等方面有一定差异，其抗干扰能力也存在差异。因此，本研究采用两个不同厂家不同灵敏度的鲎试剂对3个批号的样品进行试验。从正式干扰试验结果可见，样品稀释至83.4mg/mL浓度时，Es或Et均在0.5～2.0范围之内，可认为精制橄榄油在该浓度下不干扰细胞内毒素检查。

用两个厂家鲎试剂与3批样品进行细菌内毒素检查，样品中细菌内毒素限量均在3EU/g限值以下。因此，药用辅料精制橄榄油采用限值3EU/g进行细菌内毒素检查法控制热原质是可行的。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：附录99.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：1252.

[3]汪穗福，苏广海，劳海燕，等.对中国药典（2005年版一部）细菌内毒素检查法的建议[J].中医药信息，2004，21（1）：57-58.

[4]潘卫松，肖瑛.透明质酸钠注射液细菌内毒素检查法的研究[J].中国医药导报，2009，6（6）：45-47.

[5]潘卫松，肖瑛，潘建明.荧光素钠注射液细菌内毒素检查法的研究[J].中国药房，2009，20（13）：1010-1012.

[6]周永标，潘卫松.从葛根素的异常毒性实验看药用辅料的重要性[J].中国医药导报，2010，7（13）：47-48.

[7]潘卫松，肖瑛，李薇.皮肤组织中SOD活性测定的样品制备方法[J].中国医药导报，2010，7（32）：27-28.

[8]潘卫松，刘美凤，石钺，等.血清药理学、血清化学和中药药代动力学[J].世界科学技术一中药现代化，2002，4（3）：53-56.