张国跃 乔蓉霞 齐化元

（1.陕西省食品药品检验所，陕西西安710061；2.陕西省卫生监督所，陕西西安710054）

酱油是我国使用最广的调味品之一，由于酱油营养丰富，适于微生物生长繁殖，为了防止酱油腐败变质，保持酱油的鲜度和良好的品质，酱油中一般都会添加防腐剂苯甲酸、山梨酸。随着现代食品工业的发展，食品添加剂的超量和超范围使用现象十分严重，对食品添加剂的检测也越来越受到人们的重视。本实验用高效液相色谱法同时测定酱油中苯甲酸、山梨酸的含量，方法简便、快捷，适用于大批量样品的快速检测。本次试验共收集到六个省份共计180批样品（每省30批），测定结果表明，六个省份酱油中均有不同程度添加苯甲酸、山梨酸的情况。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Waters高效液相色谱仪，2487紫外检测器，Waters empower工作站（美国Waters公司），C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；Sartorius AGME235S电子分析天平（德国赛多利斯公司）。

1.2 对照物质

苯甲酸标准储备液（国家标准物质，GBW（E）130035 2008-3）、山梨酸标准储备液（国家标准物质，GBW（E）100007 09002），均由中国计量科学研究院提供。

1.3 试剂及试液

试验用水：符合GB/T 6682-92二级水标准；甲醇：色谱纯，经0.45μm微孔滤膜过滤；其它试剂均为分析纯。

1.4 标准溶液的制备

1.4.1 苯甲酸标准储备液 精密称取苯甲酸约0.10g，加碳酸氢钠溶液（20g/L）5mL，加热溶解，移入100mL量瓶中，加水定容至100mL，苯甲酸含量约为1mg/mL，作为储备溶液。

1.4.2 山梨酸标准储备液 国家标准物质，GBW（E）100007 09002，中国计量科学研究院提供，浓度：1.00mg/mL。

1.4.3 苯甲酸、山梨酸标准混合使用液 精密吸取苯甲酸、山梨酸各10.0mL，放入100mL量瓶中，加水至刻度。此溶液含苯甲酸、山梨酸各0.1mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤。

1.5 试样处理

称取本品5.0g，加水约40mL，用稀氨水调节pH值至约7，加水定容至50mL量瓶中，离心，取上清液，经0.45μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。

1.6 高效液相色谱条件

色谱柱：C18250mm×4.6mm，5～10μm；流动相：甲醇∶0.02mol/L乙酸铵溶液（5∶95）；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；检测器：紫外检测器，波长：230nm。

2 方法与结果

2.1 线性范围考察

分别精密吸取苯甲酸、山梨酸混合标准溶液（0.102mg/mL、0.100mg/mL）2μL、5μL、10μL、15μL、20μL、30μL，按上述色谱条件，注入高效液相色谱仪测定，以进样量（X）为横坐标，以峰面积积分值（Y）为纵坐标进行回归，回归方程分别为Y=3E+06X-80251，r=1；Y=5E+06X-158903，r=1。结果显示，进样量在0.20396～3.50947μg和0.2～3.0μg范围内，与峰面积呈良好的线性关系，见图1、2。

图1 苯甲酸线性关系图

图2 山梨酸线性关系图

2.2 精密度试验

精密吸取苯甲酸、山梨酸标准溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，重复测定7次，结果RSD%均为0.51%，表明精密度良好。

2.3 稳定性试验

取同一份样品，分别在0、1、2、4、8、12h测定，计算含量的RSD%；取同一份样品，分别在0、1、2、4、6、8、12、18h测定，苯甲酸、山梨酸含量的RSD%分别为0.78%、3.40%，稳定性好。

2.4 空白试验

取不含苯甲酸、山梨酸的样品按照1.4.1项下的方法制备试样，测定，空白试样中未出现与苯甲酸、山梨酸标准品保留时间相同的色谱峰，见图3。

图3 高效液相色谱图

2.5 重复性试验

精密称取同一样品共6份，按照1.4.1项下的方法制备试样，测定，计算RSD%。结果苯甲酸平均含量为0.8129mg/kg，RSD=1.24%；山梨酸平均含量为0.4784mg/kg，RSD=2.10%，见表1～2。

2.6 加样回收率试验

精密称取上述样品约2g，共6份，分别加入浓度分别为1.0198mg/mL和1.00mg/mL的苯甲酸、山梨酸对照品溶液各1mL，按照4.1项下的方法制备试样，测定，结果苯甲酸平均回收率为98.31%，RDS=1.43%；山梨酸平均回收率为90.26%，RDS=2.82%，按下式计算回收率。见表3、4。

2.7 最低检出浓度的确定

精密称取空白样品约1g，将1.4.2项下的混合标准溶液（浓度：苯甲酸0.1056mg/mL、山梨酸0.1mg/mL）稀释10倍，在上述空白样品中分别加入0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0mL，照1.4.1项下的方法制备试样，结果在加入混合标准稀释溶液1.0mL试样中，检测到与苯甲酸、山梨酸标准品保留时间相同的色谱峰，色谱峰面积分别为117481和130408，基线噪音信号为1.724，最低检出浓度为苯甲酸0.21mg/kg，山梨酸0.20mg/kg。

表1 苯甲酸重复性试验测定结果

表2 山梨酸重复性试验测定结果

表3 苯甲酸回收率测定结果

表4 山梨酸回收率测定结果

3 讨论

此次检测工作是按照国家食品药品监督管理局的统一部署所进行的食品安全性评价工作，共采集到在安徽、湖南、湖北、福建、广东、海南等六个省份流通环节使用的180批酱油样品，涉及到生产企业43家。各省检测到苯甲酸、山梨酸批数见表5。

结果显示：苯甲酸含量在0.05～0.94g/kg；山梨酸含量在0.02～0.59g/kg。见图4、5。

HPLC法测定酱油中苯甲酸、山梨酸的方法，样品经稀释、调节pH后定容，处理方法简单、快捷[1]，但有些样品由于浓度大、颜色深（如老抽类酱油），稀释后的颜色仍然较深，黏度偏大，可做进一步稀释[2-4]。在进行大批量样品测定时，注意色谱柱的保护，可每测定一定量的样品后，进行反冲，避免色谱柱过早毒化。张冬青[5]研究将样品经酸化后，用乙醚定量提取，然后取—部分提取液蒸发乙醚后定量溶解，再进行液相色谱测定。该方法提纯效果较好，具有处理简单、检测快速准确、易用于实际样品的测定，可用于在测定峰附近有杂质峰样品的测定[6]。

表5 各省检测到苯甲酸、山梨酸批数

图4 苯甲酸含量频数分布图

图5 山梨酸含量频数分布图

[1]卫生部食品卫生监督检验所.食品中山梨酸苯甲酸的测定方法[S].GB/TT5009.29-2003.

[2]国家标准化管理委员会.中华人民共和国国家标准：食品卫生检验方法理化部分[S].北京：中国标准出版社，1997：378.

[3]李明元.高效液相色谱法及其在食品分析中的应用[M].北京：北京大学出版社，1988：54.

[4]王晶.食品安全快速检测技术[M].北京：化学工业出版社，2002.

[5]张冬青.采用高效液相色谱法同时快速测定酱油中的苯甲酸钠、山梨酸[J].中国调味品，1997,10（22）：28-30.

[6]辛丹敏.高效液相色谱法在食品分析和药物分析中的应用研究[D].西南大学，2009：26-28.