王 玮，林国强，李楠楠，杜 艳

枪弹伤是战场上最主要外伤，限于战场条件，枪弹伤后继发感染，特别在形成脓毒血症后，在未及时救治情况下，极易形成弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)，因为在此过程中容易出现连锁的级链反应，包括促炎细胞因子产生，炎症细胞移行、外渗，炎性介质大量产生，以及凝血、纤溶系统激活，微血管通透性增加，最后导致DIC、多脏器功能衰竭和死亡［1］。如何有效防治枪弹伤感染后继发DIC 是一个重要的军事医学课题。其中白细胞介素10(interleukin-10，IL-10)属于在此过程中出现的一种作用广泛的抗炎细胞因子，在体内炎症反应及凝血功能调控方面均发挥着重要的作用［2］。本研究拟深入探讨IL-10 在外伤后感染继发DIC 过程中的作用机制，为防治外伤后感染继发DIC 提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 枪械参数 军用54 式手枪，7.62 mm 手枪弹，经专业机构校准:子弹出膛初速度430 ～435 m/s，弹丸重量5.5 g，撞击能量508.48 ～520.37 J。

实验材料:内毒素(LPS L2880 美国Sigma 公司)，凝血功能［包括凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、血小板(PLT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(FIB)］检测试剂(法国SATGO公司)，D-二聚体检测试剂盒(福州贝肯医疗设备有限公司)，IL-10、IL-1、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)单克隆抗体购自santa cruz 公司。全自动血细胞分析仪及其配套试剂(美国Beckman Coulter 公司)，全自动血凝仪(法国SATGO 公司)。

1.2 动物模型制备及分组 参考有关文献［3-4］及1999 年第六届全国血栓与止血会议修订的DIC 标准与宋善俊等［5］制定的动物模型标准，制备家兔枪弹伤后感染继发DIC 模型。DIC 评价标准:①PT 较对照组延长或缩短3 s 以上。②APTT 较对照组延长或缩短5 s 以上。③血小板较对照组下降。纤维蛋白原较对照组进行性下降。④实验组D-二聚体阳性。⑤肾脏、肺脏等脏器病理组织切片显示微血管中有纤维蛋白微血栓形成。同时有上列3 项以上异常，即判断为DIC。

实验动物采用健康家兔16 只，雌雄各半，体重(2.5±0.5)kg，由厦门大学实验动物中心提供［使用许可证号:SYXK(军)2002-047)］。实验前对动物涉及部位备皮。枪伤前动物常规禁食12 h，自由饮水。5%盐酸氯胺酮注射液20 mg/kg+0.05%硫酸阿托品注射液0.04 mg/kg 对兔臀部肌内注射麻醉后，将兔行走位悬吊，四肢自然下垂，用标准实验枪(7.62 mm钢心枪弹)距离2 m 处致伤双后肢备皮区，尽量不使股骨骨折以便饲养，予不清创包扎，如有股动脉活动性出血应予以结扎止血和包扎。

将实验家兔编号后随机分为四组，每组4 只:对照组、单纯枪弹伤组、单纯感染组、枪弹伤合并感染组。各观察时相点为经耳缘静脉滴注LPS 前1 h，及静脉滴注后2、6、12、24 h。在上述各时间点取血后行PLT、PT、APTT、TT、FIB 及D-二聚体检测。24 h 后给予氯胺酮静脉麻醉处死家兔，取右侧肺脏、肾脏置于10%甲醛中固定，行病理学检查。

1.3 酶联免疫吸附试验(ELISA)法定量检测IL-10

经耳缘静脉滴注LPS 前1 h，及静脉滴注后2、6、12、24 h 各抽取兔静脉血5 ml，置于无菌干试管，分离血清存于4℃冰箱，等待测定。根据试剂盒说明书进行各项细胞因子测试。

1.4 免疫印迹(WB)检测TNF-α、IL-1 静脉滴注LPS 后1 h 给予皮下注射IL-10(25 μg/kg)，然后取血检测TNF-α、IL-1［6］。

1.5 WB 检测应用IL-10 抗体后IL-10 表达水平静脉滴注LPS 后12 h 再皮下注射IL-10 抗体(10 mg/kg)，然后取血检测IL-10［6］。

1.6 统计学处理 用SPSS 13.0 统计软件进行数据分析，检测数据以均数±标准差()表示，组间比较采用重复测量数据方差分析，两两比较采用Dunnett t 检验，P ＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 四组家兔PLT 和凝血指标检测结果 对照组家兔凝血功能、血小板、D-二聚体检测值均符合标准参照值;单纯枪弹伤组，2 h 内APTT/PT 值及D-二聚体值较对照组变化不大，12 h 后较对照组稍延长，D-二聚体值较对照组略增加;FIB 及PLT 值变化无明显规律，均未达到DIC 诊断标准，无统计学意义;枪弹伤后感染组，2 h 内APTT 值较对照组稍延长，6 ～24 h 内APTT 较对照组、单纯外伤组明显延长;PLT 值随时间延长而呈下降趋势;D-二聚体持续阳性，且随时间延长，呈逐渐增高趋势，均呈时间依赖性，差异均有统计学意义(P ＜0.01);PT/FIB值变化规律不明显，差异无统计学意义。结合APTT、PLT、D-二聚体等指标，枪弹伤后感染2 h 即达到DIC 诊断标准，未发现明显低凝血期，而2 h 前可视为DIC 发生前期。单纯感染组综合APTT、PLT、D-二聚体等指标也达到DIC 标准，但DIC 程度较枪弹伤后感染组轻，差异有统计学意义。见表1。

2.2 各组家兔IL-10 检测结果比较 单纯枪弹伤组IL-10 水平与对照组相比，12 h 较对照组高，差异有统计学意义。枪弹伤感染组与对照组及单纯枪弹伤组相比，2 h 内IL-10 表达水平两组无明显差异;2～6 h 开始明显升高，而12 ～24 h 之间达到平台期，差异均有统计学意义(P ＜0.05)。枪弹伤感染组与单纯感染组相比则无统计学意义，见表2。

2.3 IL-10 对TNF-α、IL-1 等促炎因子影响 静脉滴注LPS 后1 h(DIC 前期)应用IL-10 治疗后可以导致TNF-α、IL-1 等促炎因子表达降低(图1)。

2.4 用药后IL-10 水平的变化 静脉滴注LPS 后12 h(DIC 发生)应用IL-10 抗体(10 mg/kg)均可以有效降低IL-10 水平(图2)。

3 讨 论

战场条件下严重感染甚至脓毒血症是枪弹伤的严重并发症之一，枪弹伤部位不同，其并发症不同，例如脏器损伤、出血休克、肝肾损害、感染等。枪弹伤和感染本身均可以通过自身机制激活凝血途径、消耗凝血因子，枪弹伤后合并感染更容易诱发DIC，其相互关联因素就在于多种细胞因子的作用。单纯应用抗生素、血浆、肝素等传统疗法，DIC 常常继续发展，死亡率仍很高。因此，如何预防及寻求新的治疗方法防治枪弹伤后感染继发DIC 具有重要的军事医学意义。为研究枪弹伤感染与DIC 关系，选择下肢枪弹伤，尽量避免产生脏器损伤等其他因素。

表1 静脉滴注LPS 前后APTT、PLT、D-二聚体变化)

表1 静脉滴注LPS 前后APTT、PLT、D-二聚体变化)

注:与对照组比较，aP ＜0.01;与单纯枪弹伤组比较，bP ＜0.01，cP ＜0.05;与单纯感染组比较，dP ＜0.05，eP ＜0.01，fP ＞0.05

指标 n－1 h 2 h 6 h 12 h 24 h APTT(s)对照组 4 17.73±0.47 17.43±0.32 17.20±0.36 17.27±0.47 17.57±0.55单纯枪弹伤组 4 17.80±0.66 17.40±0.62 21.23±0.90 21.97±1.10a 20.80±0.95单纯感染组 4 17.67±0.59 20.80±1.10a 23.63±1.03a 24.73±1.31a 22.96±1.25a枪弹伤感染组 4 16.90±0.82 22.53±0.78abd 25.50±1.20abd 27.50±1.25abd 25.76±1.20abe PLT(×109/L)对照组 4 532.33±44.65 516.00±31.76 513.33±25.03 525.36±41.49 512.66±37.09单纯枪弹伤组 4 498.66±30.53 488.00±33.51 468.50±22.55 424.33±24.33a 460.34±25.32单纯感染组 4 488.33±31.72 469.33±21.50 403.38±30.92a 277.66±17.62a 203.33±21.59a枪弹伤感染组 4 519.00±35.36 495.00±34.04 378.00±25.71abf 208.67±23.46abd 113.00±28.00abe D-二聚体(μg/μl)对照组 4 0.38±0.04 0.41±0.02 0.37±0.12 0.39±0.10 0.36±0.07单纯枪弹伤组 4 0.36±0.05 0.49±0.07 0.80±0.10a 0.95±0.18a 0.54±0.17单纯感染组 4 0.39±0.09 0.59±0.10a 1.09±0.12a 1.02±0.17a 0.82±0.09a外伤感染组 4 0.46±0.03 0.75±0.13acf 1.39±0.20abf 1.44±0.13abe 1.08±0.12abd

表2 静脉滴注LPS 前后IL-10 表达变化()

表2 静脉滴注LPS 前后IL-10 表达变化()

注:与对照组比较，aP ﹤0.01;与单纯枪弹伤组比较，bP ﹤0.01

组别 n －1 h 2 h IL-10 6(nhg /L)12 h 24 h对照组 4 7.60±0.75 8.00±1.25 7.53±0.85 7.50±1.05 8.13±0.71单纯枪弹伤组 4 7.11±0.62 8.57±0.91 9.40±0.80 10.83±1.00a 9.03±0.90枪弹伤感染组 4 6.75±1.04 10.92±0.97 17.53±1.54ab 26.03±2.33ab 28.83±3.25ab

图1 皮下注射IL-10 后TNF-α、IL-1 等炎性因子的表达

图2 WB 检测IL-10 的表达

在炎症反应与凝血系统异常之间细胞因子具有桥梁样作用，但各种不同细胞因子所起作用并不相同，TNF-α、IL-1 属于促炎因子，而IL-10 既具有抗炎因子作用，又在调节凝血功能上具有特殊意义，其在DIC 发展的不同阶段具有双刃剑作用［7］，需要进行精细调控，恰当应用IL-10 或者IL-10 抗体，可以限制枪弹伤后感染继发DIC 的进程。

在枪弹伤及随后脓毒血症形成期而尚未达到DIC 阶段可以认为处于DIC 前期，此期特别是形成脓毒血症时TNF-α、IL-1 等促炎因子表达明显增多。本实验同时检测IL-10 水平，发现其较对照组等无明显变化，但相对于TNF-α、IL-1 等促炎因子存在相对不足，此时需要增加应用IL-10 发挥其抗炎作用，从而有利于延缓或者减轻DIC 进展。而IL-10 的合成晚于促炎性细胞因子［2］，IL-10 约在枪弹伤感染后2 h 开始明显上升，并随着时间增加，说明此时IL-10的分泌过多。但是在外伤后感染向DIC 发展过程中，大量IL-10 的产生又会导致严重免疫抑制，有学者发现脓毒血症中后期IL-10 水平明显升高者其死亡率更高，就是因为其有严重的免疫抑制作用［8-9］。感染不能控制，会加重DIC 进程，故在感染及DIC发展过程中又必须发现机体代偿性分泌过多IL-10的时效性，并恰当应用IL-10 抗体中和其不良反应，防止DIC 的进展。

IL-10 对凝血功能的影响主要通过剂量依赖性抑制TNF-α 作用，间接抑制血小板活化、黏附功能以及vWF(von willebrand 因子)功能，并抑制纤溶系统激活［10］。本研究证实IL-10 可以导致TNF-α、IL-1等促炎因子表达降低，提示其抗炎机制及对凝血功能调节均与拮抗IL-1、TNF-α 的功能有关。由于TNF-α主要在严重感染及DIC 前期大量产生，故预防性应用IL-10 必须在DIC 前期才能产生好的效果。

本研究同时发现单纯下肢枪弹伤后不容易形成DIC，可能与枪弹伤强度不够有关，但加入感染因素后则很容易形成DIC，并且DIC 阳性的各项指标也较单纯感染组有实际意义，提示加强枪弹伤后感染防治是战场条件下的重要任务。

综上所述，本研究认为枪弹伤后感染极易诱发DIC，选择合适的时机应用IL-10 或者IL-10 抗体有利于治疗枪弹伤后感染继发DIC。

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