易中华 朱年华 黎观红 宋小珍 潘 珂 瞿明仁

采用体外发酵技术评价日粮纤维的营养价值（Tilley等，1963），在反刍动物营养学上已经有40多年的历史。Ehle等（1982）将这项试验技术应用到人体大肠微生物体外发酵膳食纤维上。体外发酵法具有如下优点：发酵条件一致、发酵时间一致、能够准确测定发酵产物的产量、试验费用低廉。体外发酵试验一直存在争议的是，使用粪样作为发酵菌源得出的结果能否代表肠道内微生物利用纤维的能力。Sunvold等（1995a、b、c、d） 结合体内肠道对日粮纤维的发酵，用猪、猫、狗、马、牛、人等的新鲜粪样作为发酵菌源，系统研究了甜菜渣、果胶、瓜尔胶、纤维素等几种日粮纤维的发酵特点，结果发现，以新鲜粪样作为体外发酵的菌源，有机物质消失率的测定值与体内试验测定值具有很好的相关性。Vickers等（2001）用狗盲肠菌源，比较了菊粉、果寡糖和几种日粮纤维的体外发酵特点，结果表明，菊粉和果寡糖的发酵性很高，甜菜渣、甘露寡糖和大豆纤维具有中等程度的发酵性，纤维素的发酵性最低。但上述试验的日粮纤维成分中还含有很多蛋白质等非纤维类成分，这势必对发酵结果造成干扰。

本试验的目的是采用饲喂无抗生素日粮的健康肉仔鸡盲肠菌源，通过体外发酵玉米、小麦、豆粕、小麦麸等的NSP提取物及纤维素，比较其短链脂肪酸的产量及产生速率，为评价不同饲料中非淀粉多糖（NSP）的体外发酵特性提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物及菌源

选用48只1日龄AA肉公鸡，随机分成6个笼，每笼8只鸡。试验日粮参照NRC（1994）家禽营养需要量标准，配制为玉米-大豆浓缩蛋白型日粮，不含任何抗生素，以粉料形式饲喂。试验鸡笼养，自由采食和饮水，饲养管理和免疫程序参照AA肉仔鸡饲养手册进行。试验第42 d 8:00从每笼中随机抓取2只试鸡，肌肉注射戊巴比妥钠麻醉后，将试鸡宰杀，剖开腹腔，取出盲肠，结扎固定盲肠近端，自结扎外侧剪断，用硫酸纸包扎，置于液氮中，然后转移至-80℃超低温冰箱冷冻保存。

1.2 非淀粉多糖的来源及制备

非淀粉多糖来源于滤纸纤维及玉米、豆粕、小麦和麦麸等4种饲料原料。以滤纸纤维作为纯纤维素的来源。参照Choct等（1992）的方法，从玉米、豆粕、小麦和麦麸等饲料原料中提取碱溶性NSP。

①将1 kg欲提取NSP的饲料样品粉碎（过60目筛），溶解在10 L热水中，加入α－淀粉酶1.5 ml置于80～100℃的水浴槽中培养1 h，以降解饲料样品中的淀粉。

②冷却后，加入5 g胰蛋白酶（Sigma公司）于50℃的水浴槽中培养1 h，以除去饲料样品中的蛋白质。

③培养后以1000×g转速离心30 min。

④去除上清液，将残留物加入等体积的0.2 M氢氧化钠溶液，于80℃的水浴槽中培养2 h。

⑤利用0.2 M醋酸调整至pH值为7，并以1000×g转速离心30 min。

⑥除去上清液后，再加入4倍体积的80%（v/v）乙醇溶液混和，再以13000×g转速离心30 min。

⑦取出沉淀物后，转移至60℃干燥箱中干燥，即可得到NSP。

1.3 发酵程序与样品采集

1.3.1 培养液的配置

培养液的配方参照Sunvold等(1995)的方法配置。

表1 培养液的配方

1.3.2 发酵底物处理

称取0.3 g底物（准确至0.001 g），放入250 ml葡萄糖瓶中，加入30ml培养液，于121℃高压灭菌20min。每种发酵底物按一式三份处理，设为3个重复。

1.3.3 菌源的处理

采用SPSS15.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组内比较采用单因素方差分析，组间比较采用成组t检验，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

将取回来的盲肠食糜样品在超净台室温解冻，用预先配置好的培养液以1：10（重量与体积之比）的比例稀释混匀后，用200目尼龙网过滤，取滤液，将滤液密封于250 ml葡萄糖瓶中，冲入CO2使其保持在厌氧环境中。

1.3.4 菌源对底物的发酵

向每个装有底物的葡萄糖瓶中加入1 ml处理好的菌源，冲入CO2，密封，放入37℃恒温摇床中培养6、12、24 h。在各个时间点取上清液样4 ml，用于测定发酵液的SCFA产量和pH值。

1.4 测试指标及方法

1.4.1 饲料原料的纤维成分分析

参照Lee等(1992)的酶分解比重法，分析玉米、豆粕、小麦和麦麸等4种饲料原料及其NSP提取物所含的总日粮纤维（TDF）、可溶性日粮纤维（SDF）与不可溶性日粮纤维（IDF）的含量。采用张丽英（2003）的方法，测定4种饲料原料及其NSP提取物的干物质（DM）、粗纤维（CF）和粗蛋白质（CP）的含量。

1.4.2 发酵液中短链脂肪酸浓度的测定

参照Carre等（1995）的方法，用Hewelett Packard 6890型气相色谱仪测定肠道内容物中乙酸、丙酸和丁酸的浓度。取上清液1 ml于塑料安培管中，加入1 ml的25%偏磷酸溶液，盖紧盖子，振荡摇匀，并置冰水浴中30 min；25000×g离心20 min，取上清液，上机测样。上机气相色谱条件见仪器说明书。

1.5 数据处理

原始数据经Excel初步处理后，采用SPSS 16.0软件中的One－Way ANOVY程序进行方差分析和Duncan's法多重比较。试验结果用平均数±标准差（X±S）表示，P＜0.05为有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 4种饲料原料及其碱溶性NSP提取物的纤维成分分析

玉米、小麦、豆粕和麦麸等4种饲料原料及其碱溶性NSP提取物的日粮纤维组成见表2。在饲料原料组成中，总日粮纤维或粗纤维的含量均以小麦麸为最高，总日粮纤维含量以玉米为最低，粗纤维含量以小麦为最低，且所有原料粗纤维的含量均远低于总日粮纤维的分析值；在总日粮纤维的比例中，可溶性纤维所占比例以小麦（22.07%）为最高，豆粕（20.37%）次之，小麦麸（12.16%）最低。按Choct等(1992)的方法提取玉米、小麦、豆粕和麦麸中NSP，其提取量分别为8.37%、16.48%、36.14%、50.53%均高于饲料原料中总日粮纤维的分析值。在碱溶性NSP提取物组成中，除豆粕NSP提取物粗蛋白含量高达15.45%外，其它原料NSP提取物粗蛋白含量都很低；总日粮纤维含量大幅度高于原料，且不同NSP提取物之间总日粮纤维含量的差距变小；可溶性纤维占总日粮纤维的比例仍以小麦NSP为最高，豆粕NSP次之，小麦麸NSP最低。

表2 饲料原料的日粮纤维与其碱溶性非淀粉多糖提取物的组成（%，风干基础）

2.2 非淀粉多糖体外发酵后短链脂肪酸产量和组成比例的比较

表3为肉仔鸡盲肠食糜菌源体外发酵玉米、小麦、豆粕、小麦麸等的NSP提取物及纤维素在6、12、24 h后短链脂肪酸（SCFA）产量及组成比例。小麦NSP提取物的SCFA产量及生成速率最大；豆粕NSP提取物次之，第6、12、24 h的SCFA总产量分别为小麦NSP提取物的65.38%、65.07%、71.76%；玉米NSP提取物和小麦麸NSP提取物紧随豆粕NSP提取物之后，第6、12、24 h的SCFA总产量分别为小麦NSP提取物的 61.53%、57.53%、62.75%和 55.77%、44.52%、45.10%；纤维素的可发酵性最差，第12、24 h的SCFA总产量仅为小麦NSP提取物的10.96%～14.90%。总之，5种NSP的可发酵性的顺序依次为小麦NSP＞豆粕NSP＞玉米NSP＞小麦麸NSP＞纤维素。

此外，上述NSP发酵产物SCFA组成比例均以乙酸为最多，其次为丙酸，丁酸最少；随着发酵时间的增加，丁酸比例逐渐增加，多数发酵底物在第24 h产生丁酸的比例明显增多。

3 讨论

3.1 4种饲料原料及其碱溶性NSP提取物的纤维成分分析

饲料原料中日粮纤维除构成细胞壁的纤维素外，其它成分因原料不同而有所差异。玉米和小麦中日粮纤维以阿拉伯木聚糖为主，在双子叶豆科植物中如大豆则主要为半乳甘露聚糖与酸性果胶物质。本试验分析结果表明，在总日粮纤维的比例中，可溶性纤维所占比例以小麦NSP为最高，豆粕NSP次之，小麦麸NSP最低。

表3 肉仔鸡盲肠食糜菌源发酵非淀粉多糖6、12、24 h后短链脂肪酸产量

Van Laar(2000)提取不同来源单子叶与双子叶植物胚乳细胞壁时，在单子叶植物（小麦、裸麦及玉米）细胞壁中所含的蛋白质量一般值都很低，而在双子叶植物一般约为4%左右，但大豆粕细胞壁上含有相当高的蛋白质。在NSP提取过程中，原料中存在不被酶液消化的蛋白质，以豆粕尤为明显。这是由于豆粕中的蛋白质与NSP结合的比例较大，纤维与多糖类能将蛋白质包覆，进而使消化酶难以分解（Carre等，1985），导致NSP提取物中仍存在较大比例的未消化蛋白质。在本试验中，豆粕NSP提取物粗蛋白含量为14.45%，大大低于Van Laar(2000)的报道，其它原料NSP提取物粗蛋白含量都很低。这有利于减少蛋白质对NSP提取物发酵的影响。

3.2 非淀粉多糖体外发酵后短链脂肪酸产量和组成比例的比较

肉仔鸡由于后肠较短，通常认为其对日粮纤维的发酵能力很有限。但近年来，随着功能性寡糖和无抗生素日粮研究的深入，发达国家（尤其是欧盟）正在尝试通过改变日粮纤维组成或添加外源性非消化寡糖来改善动物肠道微生态系统，以达到降低甚至停用饲用抗生素（Bedford，2000；Verstegen 等，2002）的目的，并在此基础上提出了功能性纤维的概念（Prosky,2000;Guillon等,2000;Varley,2004）。因此，有必要认识和评价肉仔鸡肠道微生物对非消化寡糖和日粮纤维的发酵利用。

体外发酵技术具有发酵条件一致、发酵时间一致、能够准确测定发酵产物的产量及试验费用低廉等优点，已被从反刍动物营养应用到非反刍动物营养上来（Ehle等，1982；Vickers等，2001）。盲肠是消化道微生物寄居肉仔鸡的主要场所，本试验体外发酵所使用的菌种来源于采食无抗生素日粮的健康肉仔鸡盲肠。结果表明，玉米、小麦、豆粕、小麦麸等的NSP提取物及纤维素发酵产物SCFA组成比例均以乙酸为最多，其次为丙酸，丁酸最少；随着发酵时间的增加，丁酸比例逐渐增加，多数发酵底物在第24 h产生丁酸的比例明显增多。试验结果与 Sunvold等（1995a、b、c、d）和Vickers等（2001）的基本一致，但短链脂肪酸产生速率更快，这可能是肉仔鸡盲肠菌群数量相对较多的原因。

本试验NSP的可发酵性的顺序依次为小麦NSP＞豆粕NSP＞玉米NSP＞小麦麸NSP＞纤维素。这是由于NSP的特性不同，造成微生物对NSP的利用能力有所差异所致。小麦麸NSP和玉米NSP主要以不溶性日粮纤维为主，小麦NSP和豆粕NSP则含可溶性日粮纤维相对较多，不同特性日粮纤维影响微生物是否能侵入纤维间隙进行水解作用。日粮纤维在降解过程中受菌种种类不同与日粮纤维组成的影响（Rao等，1994）。可溶性日粮纤维较易被微生物发酵分解，因其持水性较高，使微生物容易侵入纤维间质中，但微生物难以侵入不可溶性日粮纤维的间质，以致无法快速降解纤维（Schneeman,1987）。Salvador等（1993）指出，当纤维呈现晶体状结构时，能强烈地抵抗微生物水解酶，而小麦麸NSP为此类型的纤维结构，因此，降解速率和SCFA产量较低。当微生物无法降解纤维时，仅能产生较少的SCFA，进而影响微生物的生长与代谢。另外，某些可溶性NSP具有较高的黏滞性，也会影响肠道细菌对NSP的发酵。Choct等(1999)指出，鸡肠道内容物的黏滞性增加，使食糜通过速率减慢，并增加肠道未搅拌水层的厚度，这些现象均会减少肠道中的含氧量，而适合厌气菌的生长。在豆粕NSP组中，乙酸比例有较其它组高的趋势，这是由于豆粕中的NSP与蛋白质结合牢固，本试验提取NSP过程中虽用蛋白酶水解豆粕中的蛋白质，但粗蛋白仍达15.45%，这得以提供微生物利用，即以蛋白质为发酵作用的底物，而其产物乃以乙酸为主，故造成豆粕中含有较高比例的乙酸。Macfarlane等(1988)指出，微生物发酵时所使用的底物会影响到SCFA产量，一般以蛋白质作为发酵底物所产生的SCFA量会较以碳水化合物为基质的少。

本试验在提取NSP过程中采用碱溶性NSP提取法，为的是保留更多的可溶性NSP。结果表明，与不可溶性NSP相比，可溶性NSP的发酵特点更接近于非消化寡糖。尽管如此，非消化寡糖和可溶性NSP对动物消化生理的影响还是有其不同之处的。可溶性NSP溶解后，通过分子之间相互缠绕，共价或非共价键连接成网状结构，使水溶液呈现一定的黏滞性，这会降低胃的排空速率，影响肠道食糜的混合和营养素向肠道表皮细胞或吸收表面的扩散，结果造成饲料的消化和吸收的速率全面下降（Schwartz等，1982；Lin等，1992、1997）；与可溶性NSP不同的是，非消化寡糖在水溶液一般不表现黏滞性，但发酵产生的SCFA可增加食糜的流通速率。

4 结语

在本试验中以采食无抗生素日粮的健康肉仔鸡盲肠微生物为菌源的体外发酵条件下，以玉米、小麦、豆粕、小麦麸等的NSP提取物及纤维素为发酵底物。结果表明，上述NSP的发酵产物SCFA组成比例均以乙酸为最多，其次为丙酸，丁酸最少；随着发酵时间的增加，丁酸比例逐渐增加，多数发酵底物在第24 h产生丁酸的比例明显增多。玉米、小麦、豆粕、小麦麸等的NSP提取物及纤维素的可发酵性的顺序依次为小麦NSP＞豆粕NSP＞玉米NSP＞小麦麸NSP＞纤维素。