赫丽娟 王 鹤 任同军 姜志强 韩雨哲

维生素C又名抗坏血酸，是鱼类和哺乳动物组织胶原蛋白合成过程中脯氨酸羟基化必需的物质，具有广泛的生理和免疫作用，能够促进养殖动物快速生长，缓解养殖鱼类的应激状态，增强机体抵抗病原微生物感染能力及免疫功能[1]。维生素C对鱼类的生长发育、繁殖、抗病、抗应激和提高存活率等方面有重要的作用[2]。鱼类缺乏维生素C经常出现脊椎弯曲、软骨变形、胶原形成损伤、皮肤出血和内脏出血等症状。由于大多数鱼类缺少合成维生素C所必需的L－古洛糖酸内酯氧化酶，因此，在体内不能合成维生素C，只能通过食物获取外源维生素C[3]。饵料中缺乏维生素C容易使鱼类的生长放慢，免疫功能减弱，病害增多，死亡率提高。由于仔鱼阶段鱼苗的体质较弱，因此需要在饲料中添加适量维生素C。维生素C对水产动物生长的影响一直是鱼类营养与饲料研究的重点。

牙鲆（Paralichthys olivaceus）原产地分布于北太平洋西部，我国黄海和渤海产量较大。牙鲆以其肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富而深受人们的喜爱，市场需求旺盛，经济价值较高[4]。目前，牙鲆的营养，特别是仔、稚鱼的营养与饲料问题较突出，虽然已有部分国产饲料应用于生产,但是仍有许多生产单位育苗饲料需要依靠进口[5]。有关牙鲆对维生素C的需要报道较多，但基本上都集中在牙鲆幼鱼和成鱼阶段的研究，而对牙鲆仔鱼阶段的研究较少。文中主要研究不同剂量的维生素C对褐牙鲆仔鱼阶段存活率以及抗应激能力的影响，为配制牙鲆仔鱼的配合饲料提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验饲料

1.1.1 饲料的配制

饲料主要的蛋白源为鱼粉、磷虾粉和鱿鱼粉；基础饲料主要原料为混合维生素（不含有维生素C）、混合矿物质、n-3系列不饱和脂肪酸、鱼肝油、α-糊精等。VC的添加使用的是VC磷酸酯，VC磷酸酯的有效抗坏血酸含量为35%，并将不同量的维生素C添加到配合饲料中，使其达到试验所要求的含量标准。将这些成分加入粘合剂使之充分混合，处理成片状后烘干，24 h后取出放入研钵中研碎，过100目筛，筛下物即可作为试验饲料使用。饲料配方及饲料编号见表1。

表1 饲料配方（g/kg干物质）

1.1.2 饲料成分的测定

水分测定采用恒温干燥法(105℃)；粗蛋白测定采用半微量凯氏定氮法；粗脂肪测定采用索氏抽提法；粗灰分测定采用马福炉灼烧法(550℃)[6]。饲料的营养成分见表2。

表2 饲料的营养成分（%）

1.2 饲养管理

试验仔鱼是由中国水产科学研究院北戴河中心实验站提供的全雌牙鲆卵，在大连水产学院农业部海洋水产增养殖重点实验室孵化。前期饲养阶段，将初孵仔鱼放入170 cm×90 cm×56 cm，容积0.86 m3的暂养池中，仔鱼开口后投喂轮虫，轮虫的投喂密度为2～3个/ml水体。投喂的褶皱臂尾轮虫，是在本实验室由土池培养的轮虫休眠卵孵化而来，轮虫培养密度保持在160个/ml以上，轮虫培养前期投喂本实验室三级培养的小球藻液以及酵母，由于小球藻液数量有限，培养后期改为小球藻浓缩液。投喂前，将轮虫用稀释100倍的轮虫强化剂（0.8～0.9 g/百万个）强化12 h后投喂。经过三周的前期饲养，挑选规格整齐的仔鱼平均放入15个160 L的塑料圆桶中进行流水式养殖，每桶放牙鲆仔鱼350尾左右。仔鱼的初始规格：平均体长为（8.2±0.6）mm，平均体重为（3.8±0.5）mg。

试验由2009年3月31日至2009年4月20日，共21 d。饲养阶段7:30～17:30，每小时投饲一次。每日上午9:00虹吸法吸底，同时清除残饵及粪便，整个饲养阶段采用微流水养殖，水流速度约为0.1 l/min，24 h充气。室温使用空调控制，控制室温在整个试验过程中稳定在25℃。每天记录饲养仔鱼死亡尾数。同时测定盐度、水温以及溶氧等水质指标，试验期间，盐度为33±1，水温 15～17 ℃，溶氧 6.63～7.78 mg/l(YSI,550I,USA)。

1.3 高温应激试验和露空试验

将15桶试验仔鱼分别随机取出10尾，将仔鱼分别放入200 ml的烧杯中，将烧杯置于25℃的恒温水浴中2 h，每5 min检查其存活情况，记录死亡量。

将15桶试验仔鱼分别随机取出10尾，离水，放于干燥的筛绢网 (100目)上，5 min后，将试验仔鱼无伤的放回装有原槽水的新水槽中，3 h后观察试验仔鱼的存活情况，并记录死亡量。

1.4 计算方法

存活率(%)=[（初始尾数－死亡尾数）/初始尾数]×100。

1.5 统计分析

数据均以平均值±标准差（Mean±S.D.）表示，对试验数据进行了单因素方差分析（One－way ANOVA），并对不同处理间的数据进行Duncan's法多重比较，以P＜0.05作为差异显著的标准。数据的统计分析采用SPSS13.0软件包进行处理，并用Excel 2003制表、制图。

2 结果（见图 1、2、3）

图1 不同维生素C含量饲料对牙鲆仔鱼存活率的影响

不同维生素C含量的饲料对牙鲆仔鱼存活率的影响如图1所示。从结果可以看出，牙鲆仔鱼的存活率受饲料中维生素C含量的影响。在饲料中添加1.43 g/kg维生素C磷酸酯(L－AMP)能显著提高牙鲆仔鱼的存活率(P＜0.05)，继续升高饲料中L－AMP含量则不会继续显著提高牙鲆仔鱼的存活率。

图2 不同维生素C含量饲料对牙鲆仔鱼高温应激后存活率的影响

不同维生素C含量的饲料对牙鲆仔鱼的高温应激能力产生了影响，结果如图2所示。用不添加维生素C的饲料饲喂的牙鲆仔鱼高温应激后的存活率显著低于饲喂添加2.86 g/kg和5.72 g/kg L－AMP的饲料组(P＜0.05)，即饲料4和饲料5。饲料中添加1.43 g/kg以上维生素C磷酸酯(L－AMP)的各组间高温应激后，牙鲆仔鱼的存活率没有显著差异。

图3 不同维生素C含量饲料对牙鲆仔鱼露空应激后存活率的影响

饲料中维生素C含量的不同并未对牙鲆仔鱼抗露空应激的能力产生显著影响（见图3）。但是未添加维生素C的饲料组饲喂的牙鲆仔鱼，在露空应激后存活率最低（P＞0.05）。

3 讨论

维生素C是水产动物所必需的重要维生素。对于水产动物其主要的生理功能：首先，维生素C作为水产动物重要的免疫增强剂而发挥作用[3]。其次，维生素C能提高水产动物的抗逆性[7]。第三，维生素C对饲料中某些微量添加剂有正协同效应，起到节约饲料中的微量添加剂的作用，维生素C能促使叶酸转变成四氢叶酸，协助酪氨酸的代谢，减轻维生素A、维生素B1等的缺乏症[8]。第四，维生素C对水产动物骨骼的发育有重要的影响[7]。第五，维生素C对水产动物的行为有所影响[9]。

本研究中，饲料中添加1.43 g/kg的VC磷酸酯能显著提高牙鲆仔鱼的存活率(P＜0.05)，但是继续升高饲料中的VC含量，并不会显著提高牙鲆仔鱼的存活率(P＞0.05)。添加0.29 g/kg VC磷酸酯的饲料饲喂的牙鲆仔鱼，其存活率并未显著高于未添加VC的饲料。结果表明，饲料中添加一定量的维生素C能提高牙鲆仔鱼的存活率。这也与之前的许多试验结果类似，Ai等[7]在以L－APP为维生素C源对花鲈（Lateolabrax japonicus）维生素C需求量的试验中发现，饲料中添加489 mg/kg饲料或高于这个剂量会显著地提高血清溶菌酶活力和血清替代补体活力。Lin等[10]在石斑鱼（Epinephelus malabaricus）饲料中添加100%抗坏血酸，当添加量达到生长最适添加量（45.3 mg/kg饲料）的6倍时，能显著增强石斑鱼的非特异性免疫反应并能在攻毒试验中显著提高石斑鱼的存活率。在本试验中，当继续升高维生素C的含量时，牙鲆仔鱼存活率出现了平台期，这种现象的原因可能是由于添加维生素C产生的短暂免疫增强后，试验动物对饲料中含有高剂量的维生素C环境出现了一定的适应，并且在长期试验的后期免疫功能无法体现[11]。张道波等[12]在以牙鲆幼鱼为研究对象的试验中发现，牙鲆幼鱼饲料适宜的维生素C添加量为400～600 mg/kg。但是在本试验中，牙鲆仔鱼的适宜维生素C添加量应高于1.43 g/kg，这个结论也证明了仔鱼对维生素C的需求量高于幼鱼。

本研究的结果表明，饲料中添加维生素C能显著提高牙鲆仔鱼的抗高温应激能力(P＜0.05)。高温应激存活率最高值出现在饲料中添加维生素C 2.86 g/kg的饲料组。高于保证饲养阶段存活率最高值所需要的维生素 C 含量(P＞0.05)。Wahli等[13]在虹鳟（Oncorhynchus mykiss）的创伤恢复试验中发现，在饲料中添加维生素C能显著提高虹鳟鱼的创伤恢复能力，并且高剂量的维生素C添加量不但不会引起恢复速度的减缓反而会引起其加快恢复。Alexis等[14]在对金头鲷（Sparus aurata L.）的试验中得到了相似的结果。饲料中维生素C的含量从0 mg/kg饲料增加到3.2 g/kg饲料，同时金头鲷的创伤恢复速度与维生素C的添加量呈线性正相关。这个结果说明在应激刺激条件下，鱼类为了保证正常生理状态所必需的维生素C的量有所增加。从另一个角度反映了维生素C作为水产动物所必需的微量添加剂的生理功能。但是在露空应激试验中，这个结果却并不显著。不添加维生素C组的饲料饲喂的牙鲆仔鱼，其露空存活率仅略低于添加维生素C的各组饲料 (P＞0.05)。造成这种现象的原因可能是由于牙鲆仔鱼对高温应激的抗逆性生理反应机制与露空应激不同，从而对维生素C的利用途径不同所造成的[15]。具体的生理反应需做进一步试验证明。

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