张 俐,彭 丽,李德丽,孟繁峥

(吉林大学第一医院儿科,吉林长春 130021）

人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus,HCMV）感染在全世界分布,可引起肝脏、神经系统、血液循环系统、泌尿生殖系统等多系统的病变,其中肝脏最常受累及。先天性巨细胞病毒感染的新生儿中,常见的症状包括病理性黄疸、高胆红素血症、肝脾肿大,有些患儿甚至出现严重的肝功能损伤,发展为肝硬化、肝衰竭而死亡。其发病机制的深入探讨与治疗药物的筛选与评价,很大程度上依赖于先天性巨细胞病毒肝炎模型的建立与应用,通过建立科学性、实用性、重现性良好的实验性肝损伤动物模型,对筛选保肝药物,探索保肝作用原理,具有重要的现实意义。本研究将HCMV经腹腔接种的方式感染生育龄Balb/c雌雄小鼠并配对喂养。在繁殖后,取新生鼠肝组织进行病毒分离、病理学检查及原位杂交检测。结果提示:HCMV可垂直传播给子代,使新生鼠肝脏发生病理改变,在肝组织中可分离到该病毒;原位杂交检测显示,病毒核酸存在于受该病毒感染细胞的核内及胞浆内。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验动物健康纯系BALB/C鼠,雌雄各半,10周龄,体重约25-30 g。购自吉林大学实验动物中心。

1.2 病毒和细胞

HCMV AD169标准株、人胚肺成纤维细胞(HEL）由吉林大学基础医学院微生物教研室提供。使用前将病毒在HEL细胞上15-20次传代,以增加病毒毒力;经预实验,以6.0log TCID50/ml的病毒作为实验用毒种。

1.3 主要试剂

主要化学试剂及分子生物学试剂购自北京华美生物工程公司、武汉博士德试剂公司等。

1.4 方法

10周龄健康BALB/C雌鼠50只,雄鼠50只,随机分为感染组和对照组,雌雄各25只,随机配对。将HCMV AD169株悬液分别腹腔内注射给感染组雌雄鼠,剂量为6.0 log TCID50/只;将细胞维持液腹腔内注射给对照组小鼠,剂量为1.0 ml/只。在雌鼠分娩后取新生小鼠肝组织进行病毒分离和病理、原位杂交检测,每项检测随机选取感染组和对照组新生小鼠各30只。

1.4.1 病毒分离 病毒分离常规无菌操作下取出新生鼠肝脏制备肝细胞悬液,低速离心后,取上清直接接种至HEL细胞,同时设置正常细胞对照。对出现HCMV特征细胞病变作用者,取培养上清做PCR,检测HCMV DNA。

1.4.2 病理学分析 取新生鼠肝组织进行病理学分析,用4%甲醛固定新生属肝组织,常规脱水、石蜡包埋、切片,光学病理学检查组织病理变化。

1.4.3 原位杂交检测 原位杂交检测HCMV探针来自HCMVLA2099-2500 bp(与其他病毒基因无同源序列,地高辛标记）。将感染组和对照组新生鼠肝脏组织石蜡切片脱蜡、灭活内源性过氧化物酶,暴露DNA,100℃核酸变性,加预变性HCMV DNA探针杂交液37℃孵育过夜,加生物素化地高辛抗体,进行亲和素-辣根过氧化物酶-DAB显色,苏木素复染,光镜下检查细胞核或胞质内有棕黄色着色者判为HCMV阳性。

2 结果

2.1 新生小鼠肝组织病毒分离结果

将30份感染组新生小鼠肝组织制成的肝细胞悬液,经不同方式处理后接种细胞进行病毒分离。发现HEL细胞的细胞病变作用主要有如下表现:细胞肿胀,核变大,形成巨大细胞,折光性增强,核内及胞浆内产生大型嗜酸性或嗜碱性包涵体,这些包涵体有晕轮围绕并与核膜分离。为了进一步确定结果,用PCR法对HEL单层细胞分离培养阳性者检测HCMV-DNA,亦均得到阳性结果。证明了HCMV可经胎盘垂直传播至子代小鼠。对照组新生小鼠肝组织HEL单层细胞分离培养以及PCR检测均为阴性。

2.2 病理学研究

感染组:组织结构大致正常,肝组织中常有点状或灶状的坏死,巨核细胞可见。坏死区和汇管区均可见炎细胞浸润。核内可见“猫头鹰眼”样细胞,是由于包涵体偏于一端使细胞呈现猫头鹰眼样的改变,。局部肝脏的包膜不同程度增厚。而对照组:肝组织结构正常,个别新生鼠的汇管区见少数炎细胞浸润,肝细胞有点状坏死。

2.3 原位杂交技术检测新生小鼠肝细胞中HCMV DNA

原位杂交技术检测新生小鼠肝细胞中HCMV DNA HCMV DNA检测发现在感染组新生小鼠肝细胞(14/30）阳性率为46.67%。对照组均未见阳性的着色。

3 讨论

HCMV感染比较广泛,有研究表明,CMV在婴儿中的感染率为68.0%[1]。该病毒可长期潜伏在体内,在免疫力减退、胎儿和小婴儿时期可使多系统、多脏器受累,出现肝炎、贫血、肺炎等,其中以肝损害相对常见且明显[2]。在婴幼儿肝炎中有50%为CMV感染[3]。近年来,随着病毒学、免疫学、分子生物学及临床病理学研究的发展,CMV感染所致的肝损害的问题日益受到重视。因此,通过有效地对实验动物进行病毒接种干预,建立HCMV先天性感染导致肝脏损伤的模型,从而对HCMV感染的药物治疗、预防及其他方面的研究具有重要意义。该实验动物模型的设计应尽量模拟临床疾病的病理过程,所以建立模型的重要原则之一应是所建立的新生鼠肝炎模型尽量与人类感染HCMV后的情况相似。既往较多应用鼠巨细胞病毒(murine cytomegalovirus,MCMV）感染小鼠模型来作研究HCMV感染。但是,HCMV可以通过胎盘使处于发育中的胚胎发生先天性感染[4],而小鼠经自然途径被MCMV感染却不能通过胎盘感染子代。因此,MCMV对于此项研究并不十分适合。

本文将HCMV AD169株接种至生育龄雌雄BALB/C小鼠腹腔内,可以导致成年鼠HCMV原发性感染,但由于此年龄段雌鼠可发生病毒血症,却因为对病毒有一定程度的防御抵抗能力而不发病、不死亡。这种情形与人类大多数孕妇原发感染HCMV时常无任何临床症状相似;但病毒却可经胎盘传给胎儿。HCMV被认为具有较严格的种属特异性,但HCMV AD169株作为标准毒种已在体外广泛传代并冷藏多年;HCMV可经小鼠胎盘垂直传播至胎儿的脑组织已经被实验证实[5]。结果表明,BALB/C小鼠用于HCMV先天性感染致新生鼠肝炎模型的优点如下:(1）BALB/C小鼠个体差异小,遗传背景均一,基因改造技术成熟,且生理生化和发育与人类相似,试验结果精确可靠,与鼠相关的细胞类型、免疫球蛋白、细胞因子等试剂已商品化,繁殖快,费用和饲养要求低。因此具有较高的可行性、可重复性和经济性。(2）感染小鼠分娩新生鼠模拟了HCMV在自然宿主中的一些主要先天性感染特征;使该疾病动物模型与人类疾病具有较高的相似性。(3）在新生小鼠肝组织的细胞水平和分子水平上均证实有HCMV感染存在;故该模型研究所获资料可以证实人类HCMV的垂直传播导致肝炎。

[1]Gong S,Dong Y.Cytomegalovivus infection in children′s livertissues[J].Tongji Med Univ,1998,18(3）:153.

[2]BolgerG,Lapeyre N,Rheaume M,et al.Acute murinecytomegalovirus infection∶A model for determiningantiviral activity against CMV induced hepatitis[J].Antioiral Res,1999,44(3）∶155.

[3]唐柳平,王 琼.婴儿巨细胞病毒感染与肝功能变化的探讨[J].中国误诊学杂志,2009,9(25）:6076.

[4]Jr Mocarski E S.Cytomegalovirus Biology and Replication.The Human Herpesviruses[M].New York:Raven Press,Ltd.1993,173.

[5]王明丽,唐久来,胡 闻,等.人巨细胞病毒先天性中枢神经系统感染小鼠模型的建立[J].动物学报,2000,46(2）:167.