陈要朋,刘铁牛,黄 丽

（解放军第303医院 检验科,广西 南宁 530021）

目前,在新兵体检中各医院都采用酶联免疫吸附试验（ELISA）做为HBsAg的检测方法,但由于不同酶联免疫吸附试验的试剂存在不同的灵敏度差异,加之各种人为因素的影响,不同体检单位对HBsAg弱阳性标本发出不同的检测报告,因而造成接送兵单位的矛盾以及人力物力的浪费,终极鉴定医院,应该采用什么样的检测方法对于弱阳性标本进到终极鉴定都值得我们研究和商确。

1 弱阳性反应的概念

ELISA检测HBsAg是一种定性检测,其报告结果是以Cut off为界,大于Cutoff值的报为“阳性”,反之则为“阴性”。对于强反应性和明显阴性的标本,检测结果的准确性较好,但是在检测过程中不可避免的会出现一些处于Cutoff值周围的弱反应性结果,即临界结果。这部分结果常易出现低值弱阳性误报为阴性的现象,或是处于Cutoff值以下附近的阴性结果误报为阳性的现象,即假阴性和假阳性,造成实验性误（漏）诊的发生,使不同的检测单位甚至同一检测单位内结果不具有可比性,给接送兵单位的工作带来极大的困难。因此找到理想解决方法是ELISA检测HBsAg有待于解决的重要问题。

2 弱阳性反应的临床意义

2.1 近年来,临床上ELISA检测HBsAg呈弱反应性的标本日益增多,其原因可能是多方面的:①血清HBsAg含量呈低水平存在,低于所用方法的测定下限,如感染的“窗口期”、急性期后或恢复期、自限性感染末期的携带者等;②HBsAg隐匿在HBsAg/抗-HBs复合物中;③病毒整合后基因替代突变缺失或重排;④HBV变异株产生HBsAg缺陷,抗原免疫源性改变;⑤钩状效应（hook effect）;⑥丙型肝炎病毒（HCV）与丁型肝炎病毒（HDV）重叠感染对HBV复制和（或）HBsAg的表达的抑制作用;⑦测定方法所用抗体对HBV不同基因型检测敏感性的不同;⑧干扰因素:内源性干扰因素如类风湿因子、补体、异嗜性抗体、治疗性抗体、溶菌酶等,外源性干扰因素如溶血、细菌污染、标本贮存时间过长、凝固不全等。另外,标本及操作因素等多方面原因也会造成假阳性[1]。

2.2 HBsAg存在于HBV的外壳部分,是乙肝患者血清中首先出现的病毒标志物,可用于乙肝的早期诊断和普查,在急性肝炎潜伏期即可出现阳性,也有利于肝移植后乙型肝炎复发的早期发现。但是在HBV感染人群中,有一部分血清HB-sAg呈低水平状态存在,并且部分感染者存在病毒复制,此类标本在进行检测时,因检测方法灵敏度的差异,“灰区”设置的局限性,极易出现弱阳性或是假阴性的现象。因此,对以低水平存在的血液HBsAg进行有效而准确的检测具有重要的临床和流行病学意义。

2.3 有研究发现,产生HBsAg弱阳性的现象可能是患者免疫功能受损后,机体与HBV或其应答产物产生新的免疫平衡反应,一般情况下不具严重致病性,但部分滴度低的HB-sAg阳性者仍存在HBV复制,因此在机体免疫功能受损时可导致肝脏病情加重,甚至癌变。此外,输血传播乙肝病毒（HBV）的危险是输血常见的不良反应和并发症。HBsAg为HBV感染的最主要检测指标和最直接证据之一,是采供血机构筛查献血者血液的必检项目。一般ELISA试剂盒检测灵敏度为1.0 ng/ml,而质佳的试剂盒可达到0.1-0.5 ng/m l,而一般认为0.1 ng/m l HBsAg即有传染性,因此该标准用于血液筛查会造成部分低水平HBV感染者不能检出,存在着潜在的经输血传播HBV的风险[2,3]。

2.4 HBsAg的检测结果对于献血、征兵、升学、就业、临床诊断都具有重要意义,其结果的准确性显得尤为重要。对于体检人群HBsAg的报告更应谨慎,弱反应标本产生的假阳性结果造成的误诊,可能会影响体检人群身心健康。因此,日常工作中要重视对弱反应性标本的结果报告解释问题,建议被检者进行动态观察检测,并要进行两对半、抗HBc IgM、HBV DNA和肝功能检测,结合临床表现,如反应性有趋强或其他相关指标也出现阳性反应,则可明确感染状态[4]。

3 ELISA的实验原理及干扰因素

ELISA检测HBsAg的原理是以已知抗体（抗HBs）包被载体,然后将含有抗原的待检标本加入,共同孵育后,抗原结合于包被抗体上,再加入酶（常使用HRP）标记特异抗体（酶标抗HBs）,酶标抗体连接到抗原上,最后加入底物溶液,根据颜色反应来判定抗原含量。其优点在于它操作简单、适合于大批量标本的测定,且成本低廉,灵敏度也很好。但其检测时易受试剂、标本、操作等诸多因素影响,因此,控制好实验过程中的各个环节,是保证检测结果准确性的重要条件。

3.1 仪器和试剂

要保证实验中用到的各种仪器设备处于良好的工作状态。所用试剂须是正规厂家生产的具有批检合格报告的试剂,且在试剂有效期内使用。不同厂家生产的试剂存在较大差异,应选择特异性好,灵敏度高,且稳定的检测试剂盒。试剂盒拆封前应检查包装是否完好,试剂是否齐全,是否有漏液等,检测前置室温条件下平衡30min,恢复至室温方可拆封进行检测,避免温度过低在微孔板底形成冷凝水影响检验结果。研究表明,平衡时间在30 min时间以内,灰区及阳性标本的吸光度会随着平衡时间的延长而增高[6]。

3.2 标本的处理

使用新鲜血清标本检测,放置过久会被细菌污染,细菌分泌的酶可能对抗原抗体蛋白产生分解作用。菌体中可能含有内源性HRP,造成非特异性干扰。此外,血清的质量还受以下内源性因素的影响:（1）类风湿因子（RF）RF可与固相包被的抗体及酶标抗体结合,从而出现假阳性结果。（2）补体固相包被抗体和酶标记二抗在固相吸附及结合过程中,其Fc段的补体C1q结合点被暴露出来,成为一个中介物将二者交联,从而出现假阳性。此外补体可封闭抗体的抗原结合位点,从而引起假阴性结果。（3）异嗜性抗体异嗜性抗体（人类血清中含有抗啮齿类动物Ig抗体）可通过交联固相和酶标抗体而出现假阳性结果。（4）自身抗体自身抗体能与其相应靶抗原结合形成复合物,从而干扰抗原的测定。标本抽取后应放置一段时间,待其充分凝集后,加大离心速度和时间,使红细胞和纤维蛋白完全沉淀。血液未开始凝固或凝固不完全时就强行离心,血清中仍残留部分纤维蛋白原,容易出现纤维蛋白结块造成假阳性结果。标本分离时应避免溶血,因为血红蛋白具有类似于过氧化物酶活性,导致非特异性显色而出现假阳性结果[5]。

3.3 实验操作

实验过程应严格按照操作说明进行。加样时使用一次性吸头,避免交叉污染。所加物应加在板孔底部,不可加在孔壁上部,不可溅出,不可产生气泡,同时要保证加样时间（从标本加入后直到酶标抗体加入的时间差）的一致性。严格控制好温育的温度和时间,由于酶标板周围与中间升降温速率不同,易造成“边缘效应”,导致中央孔与周围孔吸光度（A）有差异。因此温育时尽可能采用水浴,将微孔板浮于水面上,以便使温度迅速平衡,温育时间相差不宜超过3min。同时应贴上封膜,防止样本和酶结合物蒸发而影响结果[6]。洗板应充分且干净,避免孔间交叉污染。加入显色剂进行显色前,应留意显色剂是否本身已经变色,加入终止液后应在10min内完成比色,防止时间过长颜色改变导致结果不准。此外,每次试验均应设空白、阴阳性对照等内对照,以评价检测结果的有效性。

4 结果报告及处理建议

当出现弱阳性结果时,因其吸光值接近Cut off值,测定时易发生错误,当初次检测结果为弱阳性时,不能贸然发出报告,应根据本实验室情况合理选择复检方法进行复查。献血员的筛检应偏重于临界阴性血样的复检,复检结果仍为临界阴性的,应告知采血机构尽可能不用此类血源。体检人员应偏重于临界阳性标本的复检,复检结果仍为临界阳性的,可报告“可疑”,并建议受检者作进一步的复查,改用灵敏度较高的免疫测定方法或定量的基因扩增方法,不要轻易地发阳性报告。患者复检结果仍为临界阴、阳性的,应综合分析其他标志物的检测结果,如非初诊患者还可以查阅以往的检测结果,了解临床用药等情况做出阴性、弱阳性、可疑报告;也可以与临床医生沟通,报告测定结果S/CO的比值,供临床医生参考[7],接兵医生对此应有全面的了解,终极鉴定医院尽量统一鉴定试验的方法学,如出现弱阳性不同结果,尽量尊重第一家鉴定医院的结果。

[1]刘荣静,习 浩,林列坤.乙型肝炎病毒表面抗原弱反应性标本的检测及临床意义[J].检验医学与临床.2010,7（5）:404.

[2]容 莹,孙秀双,郑望春,等.乙型肝炎表面抗原检测结果分析及灰区设置探讨[J].检验医学与临床,2010,7（15）:1593.

[3]吴香敏,姜玉章,余亚新.HBsAg低值弱阳性的临床价值探讨[J].Youjiang Medical Journal.2003,31（6）:542.

[4]黄 芬,王茂峰,万汝根.体检人群乙型肝炎表面抗原检测弱反应的分析与对策[J].浙江实用医学.2010,15（3）:230.

[5]汤春园,陈 栋,李 山,等.ELISA检测HBsAg弱阳性标本的问题探讨[J].应用预防医学,2007,13（6）:375.

[6]胡 焰,韩光宇.ELISA检测HBsAg影响因素探析[J].中国误诊学杂志,2010,10（31）:7670.

[7]杜艳霞,刘学君.酶联免疫吸附试验检测肝炎病毒血清标志物临界结果报告的探讨[J].中国实用医药,2009,4（17）:120.

[8]谭凌卉.ELISA法检测HBV血清标志物影响因素的分析[J].湖南师范大学学报（医学版）,2009,6（2）:20.