李 ,李永哲

（中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院风湿免疫科,北京 100032）

原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis,PBC）是器官特异性自身免疫性疾病,病理组织学出现肝脏门静脉炎症和肝内胆管免疫介导损伤,体内产生多种自身抗体为主要特点,PBC确切的发病机制仍未完全阐明,自身抗体的存在对PBC的诊断具有重要的价值。中国PBC的发病率和死亡率明显高于世界其他地区[1],PBC已成为我国肝脏疾病的重要组成部分。美国肝脏病学会2009年PBC诊疗指南将抗线粒体抗体（Anti-mitochondrialantibody,AMA）存在仍然是确诊PBC的标准之一[2]。我们对PBC自身抗体、靶抗原及其临床意义和发病机制相关的文献进行阐述。

1 PBC特异性自身抗体

如抗线粒体抗体M2亚型（AMA-M2）,抗gp210（antigp210）抗体,抗sp100（anti-sp100）抗体,以及近年来发现的抗sp140（anti-sp140）抗体,对于PBC的诊断,特别是对于AMA阴性的PBC患者,具有重要的临床价值。特异性自身抗体的Ig类型或IgG亚型甚至与疾病进程有密切的相关性,例如,PBC患者AMA-IgG3亚型与疾病的严重程度相关[3],而存在核膜型抗核抗体的PBC患者,血清胆红素水平也较抗体阴性的患者高,肝脏病理显示炎性浸润更为严重,疾病情况通常较重,极易出现肝硬化或其他并发症[4]。

1.1 AMA 是诊断PBC特异性的自身抗体,90-95%的PBC患者体内存在AMA。PBC患者在临床症状出现前十余年,AMA已出现在患者血清中,PBC患者体内的AMA并不因治疗或肝脏移植而从体内清除[5]。有报道其他疾病如自身免疫性肝炎（Autoimmune hepatitis,AIH）,干燥综合征（Sjogren's synd rome,SS）,急性肝衰竭,肺结核等也存在AMA,但 PBC患者AMA存在的特点在疾病诊断的地位是显而易见的。PBC相关的AMA主要有:AMA-M2,AMA-M 4,AMA-M8和AMA-M9四种亚型,以及新发现的抗线粒体蛋白60 kDa和80 kDa抗体。

1.1.1 AMA-M2 AMA-M2亚型抗体靶抗原是线粒体内膜成分,为2-氧酸脱氢酶复合体（2-OADC）家族的成员,包括丙酮酸脱氢酶复合体E2亚基（PDC-E2）,支链2-氧酸脱氢酶复合体E2亚基（BCOADC-E2）,α-酮戊二酸脱氢酶复合体（OGDC）以及二氢硫辛酰胺脱氢酶E3结合蛋白（E3BP）。PBC中约90-95%的AMA-M2靶抗原为PDC-E2。研究发现,PBC患者唾液和血清中存在的抗IgA-PDC-E2疾病的进展有很强的相关性[6]。人的PDC-E2是含有四个结构域,全长为560个氨基酸的蛋白,分别为:外酯酰区1-80位肽段、内酯酰区133-217位肽段、E1/E3结合区272-303位肽段和催化结构域331-561位肽段。先前的研究表明AMA针对PDC-E2的反应性集中在内酯酰区的167-184和165-178肽段。而最新的研究表明,长达230个氨基酸的催化结构域也和AMA存在反应性。Sand ra等根据PDC-E2序列,合成33个长度为25个氨基酸的肽段作为靶抗原,对95例AMA-M2阳性PBC患者的血清进行检测。结果发现抗催化结构域475-499和407-431肽段阳性率分别为74%和58%,远高于167-184肽段5%的阳性率[7]。

1.1.2 AMA-M 4,M8,M9 抗M4,M 8,M9抗体的靶抗原定位均在线粒体外膜。经鉴定M4抗原片段中的蛋白可能和PDC-E1相关。PDC-E1和PDC-E2相比缺少了一个脂酰区结合位点,其包括两个亚基:PDC-E1α和 PDC-E1β,Berg将这两个亚基进行亲和纯化,来检测57名PBC患者抗PDC-E1抗体的反应性,阳性率分别为74%和67%[8]。抗M8抗体仅能在抗M2抗体阳性的患者中检测到,而抗M 2,M4和M8抗体的同时存在则是预示疾病活动性的可靠指标。抗M 9抗体能在抗M2抗体阴性的PBC患者中检测到,提示抗M9抗体可作为疾病早期抗M2抗体仍为阴性时,PBC患者的早期诊断。抗M2,M4,M8,M9抗体的联合检测,可在PBC疾病早期区分良、恶性进展[9],这对疾病治疗有积极的作用。

1.1.3 抗线粒体蛋白60 KDa和80 KDa抗体 目前,临床常规检测均采用间接免疫荧光法（Immunofluorescence assay,IFA）法对AMA进行筛查实验,对于阳性的标本再进行AMA-M2的确证实验。但是部分标本在免疫荧光中呈现出典型的AMA反应性,而经多种AMA-M2常规实验方法验证却不能找到AMA-M2存在的证据。Feuchtinger针对这部分AMA进行了详细的研究,发现这类抗体针对的靶抗原是线粒体蛋白中60 KDa和80 KDa大小的蛋白。纯化这两种蛋白进行扩大样本验证,发现IFA-AMA+/AMA-M2-的患者这两种抗体的阳性率为59%,而其他肝病及非肝病对照组均未出现阳性反应。采用MALDI-TOF进一步分析,证实60 KDa的线粒体蛋白是由线粒体F1F0-ATP酶、辅酶Q细胞色素C还原酶和酰基辅酶A脱氢酶组成,而80KDa蛋白有待进一步的研究[10]。

1.1.4 PBC产生AMA产生机制 先前的研究着重病原微生物分子模拟机制对PBC发病的阐述,近年的研究扩展至其他更广的领域,以此来解释AMA产生的机制和PBC的发病:对抗环境所致的氧化应激导致肝脏中胆管上皮细胞（BEC）的凋亡增加可能是PBC的最先驱动者[11]。正常情况下,凋亡的BEC可被单核巨噬细胞吞噬而清除。但Allina发现PBC患者体内因存在抗CD16抗体,以致巨噬细胞吞噬调理作用的延迟,清除凋亡细胞的功能受损,进一步导致继发的坏死和后续凋亡细胞内成分的释放[12]。国外学者证实BEC中释放的PDC-E2是未加修饰的,而其他类型的细胞若在凋亡过程中释放出PDC-E2是不具有抗原性的,这可能和PBC患者自身抗原PDC-E2的能阻止自身抗体识别的谷胱甘肽的丢失有关[13]。当在这样一个内环境因素的促进作用下,凋亡的BEC释放出的线粒体抗原,打破了机体对自身抗原的耐受,最终产生了AMA。PBC的AMA产生以及持续的存在是多种因素共同作用的结果。PBC患者AMA在一级亲属中的流行率达13.1%,女性一级亲属的流行率更是高达26%,而年龄性别匹配的对照组仅为1%,这暗示AMA的产生可能和遗传及环境因素有密切的关系[14]。

1.1.5 关于AMA阴性PBC的研究 PBC中仍然有5%-10%的AMA阴性的患者。据多项研究表明,这些AMA阴性的PBC患者,无论在临床表现,生化指标,外周血调节性T细胞（Treg）百分率,组织学病理表现或是治疗疗效和预后[15,16],与AMA阳性的PBC患者均无差别。Dähnrich等研发出新的ELISA,将MIT3混合物以及纯化的PDC组合作为靶抗原,检测AMA的敏感性达到93.6%,远高于常规的检测方法[17]。另有学者将PDC-E2,BCOADC-E2以及OGDC-E2包被到微球上进行AMA的检测,结果发现,经多种传统方法界定为AMA阴性的PBC患者中有20%均检测到抗M2抗体[18]。随着AMA血清学诊断不断发展,灵敏度和特异度的不断提高,这些被认为是AMA阴性的PBC病人,他们的AMA很可能是阳性的。因此,“AMA阴性的PBC”的描述已是被抛弃的说法[19],更多的学者认为AMA阴性的PBC不是一个独立的临床实体,而是AMA阳性PBC的一个变型。

1.2 抗核膜型抗核抗体（Anti-nuclear envelope autoantibodies） 核包膜是双分子层膜结构,可以分为5部分:内层核膜,拥有独特的结合膜蛋白;外层核膜;核周隙,与内质网腔连接;微孔区域,内层核膜和外层核膜交汇融合而成;核板层,包含核纤层蛋白。PBC核膜型抗核抗体的阳性率约为16%-30%[20]。有学者以HEP-2细胞作为实验基质,总IgG为二抗检测PBC患者抗核抗体,核膜型和核点型抗核抗体的阳性率为34%,而当采用IgG亚型-IgG1,IgG2,IgG3,IgG4作为二抗时发现80%的PBC患者核膜型和核点型抗核抗体为阳性[21]。IgG亚型检测PBC抗核抗体具有较高的灵敏度和特异性,这提示临床上疑似PBC的患者,而常规检测（如AMA）呈阴性反应,不支持PBC的诊断时,可以考虑采用IgG亚型对其抗核抗体做进一步检测。

1.2.1 抗板层素抗体（Anti-lamina autoantibodies,ALA）和抗板层素受体B抗体（anti-lamina B receptor,LBR） ALA包括三种亚型:抗核纤层蛋白A,B,C。其在PBC中的阳性率分别为6.8%,1%和1%[22]。ALA也并不是PBC疾病特有的自身抗体,它能在多种疾病中检测到,如SLE,自身免疫性肝病,慢性疲劳综合征。通常情况下,PBC患者血清中能同时检测到ALA-A和C,而ALA-B很少出现或 A、B、C三者很少同时出现。

LBR是可连接板层B的核内膜多肽蛋白,抗原表位于核包膜区核胞浆侧抗原多肽蛋白带氨基末端区。抗LBR是PBC高特异性的自身抗体。尽管此抗体在PBC中仅有8.7%的阳性率,但其特异性可高达100%。

1.2.2 抗gp210（anti-gp210 autoantibodies）和抗 p62抗体（antip62 autoantibodies） 核孔区域是PBC抗体识别核包膜自身抗原的另一个区域,主要为核孔复合物的相关蛋白:gp 210糖蛋白,p 62核孔蛋白。PBC抗gp 210抗体的阳性率为25%,是疾病特异性的自身抗体。抗gp 210抗体阳性的PBC患者易出现哮喘,关节痛等症状和肝外相关疾病,和疾病的严重程度及预后相关,这类患者mayo危险指数相对较高,易发展成肝衰竭[4]。最新的研究表明,当使用gp 210 C末端多肽作为靶抗原进行抗体测定时,敏感性可达33%,同时抗gp 210 C末端多肽抗体能监测PBC患者经熊去氧胆酸的治疗效果,可作为疾病预后的有力指标[23]。

另一抗核孔复合物抗体,抗p 62抗体,在PBC的流行率约为55%。有学者分别将鼠和人的p 62蛋白作为靶抗原和PBC患者血清反应,发现和抗人的p 62抗体反应性要比和鼠的高15%。另外来自国外的一项多中心研究显示:PBC病理组织学Ⅳ期的患者出现抗p 62抗体的频率远高于Ⅰ-Ⅲ期的患者[24],这表明,p 62抗体和PBC疾病的进展及恶化程度相关。

1.3 抗核点型抗核抗体（anti-nuclear dots autoantibodies）

PBC患者通常在间接免疫荧光法检测抗核抗体时出现核点型抗核抗体。核点型抗核抗体主要的靶抗原包括:sp 100蛋白,主要存在于PBC患者中的一种转录激活蛋白;早幼粒细胞白血病蛋白（PML）,为细胞转化和生长抑制蛋白,异常表达在早幼粒细胞白血病细胞,最早在急性早幼粒白血病患者的白血病细胞中发现,是和维甲酸受体融合的蛋白;核点蛋白52（NDP52）,是最新发现的核点型蛋白,为肌球蛋白VI结合配偶体蛋白,对天然免疫起促进作用[25],能和抗核点型抗体反应,IFA检测时出现核点型荧光。

1.3.1 抗sp-100抗体（Anti-sp100 autoantibodies）和抗PML抗体（Anti-PML autoantibodies） PBC中抗sp-100抗体的阳性率大约为25%,在排除了其他的疾病的可能性,并且符合PBC的临床表现的情况下,特别是对于AMA阴性的患者来说来说,抗sp-100抗体对PBC的诊断具有高度的特异性。值得注意的是,非肝脏性疾病的泌尿道感染妇女,80%出现AMA和抗sp 100抗体阳性。同样,在PBC中,74%的患者存在泌尿道感染,这部分患者抗sp 100抗体也是阳性的[26]。此数据支持大肠杆菌感染参与PBC特异性自身免疫的诱导这一观点,也说明病原微生物感染可能和PBC的发病以及抗sp 100抗体产生密切相关。PBC患者出现抗PML抗体的频率大约为19%,它通常和抗sp 100抗体共存于PBC患者体内[27],是PBC高度特异的自身抗体。

1.3.2 抗sp 140抗 体（anti-sp 140 autoantibodies） 抗sp 140抗体是在PBC患者体内发现的最新的核点型抗核抗体,阳性率约为15%,对PBC具有高度的诊断价值。PML、Sp 100以及sp 140均为核体成分,sp 140的羧基末端包含一个同源框及一个具有高度保守性的溴区结构,而氨基末端约50%的氨基序列和sp 100的氨基末端相同。基于三者结构上的特点,报道还发现了抗sp 140抗体通常和抗sp 100以及抗PML共存于PBC患者体内的现象[28]。但无迹象表明抗sp 140抗体和PBC特定的临床表现有关。

2 PBC相关自身抗体

纵观国内外文献,我们不难发现,PBC患者体内出现的自身抗体不仅仅局限于上述几种具有诊断特异性的自身抗体,更多其他疾病相关的自身抗体也能在PBC中检测到,其中不乏被认为是其他疾病特异性的自身抗体。对于此类自身抗体的研究,能给PBC发病机制的探索以及寻找临床症状及治疗相关的指标提供帮助。以下重点介绍PBC中阳性率较高或与疾病病程相关的自身抗体。

2.1 抗着丝点抗体（anti-centromere antibodies,ACA）

ACA主要存在局限性硬皮病,SS,PBC及SLE等自身免疫性疾病中。ACA阳性的患者在临床上易出现雷诺现象,周围神经病变,关节痛,肺毛细血管扩张[29]。PBC中ACA阳性的患者,易形成门脉高压。ACA阳性的SS患者肝脏受累的风险极高,这也可能是 SS易伴发PBC的一个重要的原因[30]。PBC患者ACA的阳性率约为18%-30%。现已发现多种ACA靶抗原,包括:着丝点蛋白A（CENP-A）,CENP-B,CENP-C和CENP-O。PBC的ACA亚型几乎均是针对CENP-B蛋白。方法学上,重组的CENP-B蛋白作为靶抗原的ELISA法比间接免疫荧光法具有更高的敏感性,很有潜力成为诊断合并其他自身免疫性疾病的PBC的筛查诊断试验。

2.2 抗酿酒酵母细胞抗体（anti-saccharomyces cerevisia antibody,ASCA）

ASCA是针对酿酒酵母菌（sacchromyces cerevisia）细胞壁甘露聚糖成分的抗体,常用于炎症性肠病（IBD）中的克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）诊断、鉴别诊断,其在IBD中的阳性率约为55%-65%。Wahiba Sak ly对95名PBC患者进行ASCA的检测,发现PBC患者ASCA的阳性率约为24.2%[31]。ASCA在PBC中产生的原因考虑和PBC患者肠渗透性的异常增高相关,这种不平衡的内环境可能使环境中存在的酿酒酵母菌细胞壁的甘露聚糖作为异常抗原暴露于机体的免疫系统,从而产生ASCA[32]。本课题组在国家相关基金的支持下,也对中国人群中的162名PBC患者ASCA抗体的阳性情况及其在PBC中的临床意义进行了研究,结果显示,PBC患者的ASCA阳性率为29.0%,和Wahiba Sak ly报道相似,且发现ASCA-IgA和PBC患者的病情发展密切相关。

2.3 抗心磷脂抗体（anti-Cardiolipin autoantibodies,aCL）和抗β2-糖蛋白1抗体（anti-Beta（2）-glycop rotein I autoantibodies,B2GP I）

抗磷脂抗体（aPL）是抗磷脂综合征的主要血清学证据,其检测的是一种异种基因的、一组针对各种带负电荷磷脂的自身抗体。心磷脂和和β2糖蛋白1是aPL重要的靶抗原。Gabeta等于2008年对自身免疫性肝病中这两种抗体的表达进行了详细的研究,发现IgA anti-B2GP I在96例PBC中的阳性率为27%,IgA aCL的阳性率为13.5%,作者进一步对抗体阳性与阴性PBC患者的临床表现,生化及免疫学指标进行分析,结果显示,这两个抗体阳性的PBC患者在肝功能及免疫学指标上的异常要明显大于抗体阴性的患者,而且抗体阳性的患者出现肝硬化的比例要远高于抗体阴性的PBC患者[33]。

2.4 抗胃壁细胞抗体（Anti-parietal cell autoantibodies,PCA）

PCA通常出现在内分泌性AID中,如Grave's病,胰岛素依赖型糖尿病等,阳性率约为20%-30%。其靶抗原是位于胃黏膜壁细胞内的H+/K+ATP酶,该酶负责胃酸的运输。Ciesek对72例行肝脏移植术的PBC患者进行了长达10年的随访研究,结果发现,72例患者肝移植术前和术后的APCA阳性率为41%和47%。值得注意的是,在长达十年的随访期中,经组织学鉴定为PBC复发的患者34名患者均出现 了PCA,而这部分患者术前PCA的阳性率仅为54%[34]。这提示,尽管PCA并不是PBC特异性的自身抗体,但对于其在肝脏移植术后复发的PBC患者来说,是能取代肝组织活检以此来鉴定PBC复发的简单、经济可行的方法。

3 小结

综上所述,新的靶抗原及靶抗原表位的发现,以及疾病特异性、非特异性自身抗体的研究对于PBC发病机制以及临床相关性的的了解带来了新的契机。自身抗体的存在是AID诊断、治疗及预后不可缺少的生物学证据。PBC患者体内存在的自身抗体种类远超出我们的预计范围。随着研究的不断深入,方法学的不断改进,更多抗体或针对靶抗原特异性表位的检测手段应用到临床实践工作中这对于PBC发病机制的了解,以及临床诊断、治疗预后都有很强的现实意义。

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