狄昌萍，孙 颖，李 璐，徐 艳

(南京医科大学口腔医学研究所，南京医科大学附属口腔医院牙周科，江苏南京 210029)

硝苯地平导致牙龈增生机制的研究

狄昌萍，孙 颖，李 璐，徐 艳

(南京医科大学口腔医学研究所，南京医科大学附属口腔医院牙周科，江苏南京 210029)

目的:在牙龈成纤维细胞(gingival fibroblasts(GFs))与牙龈角质形成细胞(gingival keratinocytes，GKs)共培养下，研究硝苯地平导致牙龈增生的可能机制。方法:用不同浓度(0、0.2、20 μg/mL)硝苯地平处理GFs和GKs的共培养体系，3d后用逆转录PCR、酶联免疫吸附实验以及流式细胞计数等方法观察角质细胞生长因子(keratinocytegrowth factor，KGF)及其受体(keratinocytegrowth factor receptor，KGFR)的表达。结果:在共培养条件下，硝苯地平导致GFs表达KGF显著增高，并呈浓度依赖性。同时硝苯地平能促进GKs中KGFR基因表达上调，膜KGFR蛋白表达水平在硝苯地平浓度为0.2 μg/mL时上调。结论:间充质－上皮作用途径之一的角质细胞生长因子－受体间相互影响，在硝苯地平导致牙龈增生中起着一定的作用;体外GFs－GKs共培养模型能够在更接近体内环境的状态下进一步研究牙龈增生的机制。

硝苯地平;牙龈增生;共培养;角质细胞生长因子;角质细胞生长因子受体

［牙体牙髓牙周病学杂志，2011，21(1):14］

［Chinese Journal of Conservativedentistry，2011，21(1):14］

增生性病变可以发生在很多组织，如肝脏、前列腺、乳腺以及牙龈等，主要以细胞外基质的积累、成纤维细胞的增多以及上皮增厚为特点［1］。药物性牙龈增生(drug－inducedgingival hyperplasia)是指长期服用某些药物而引起的牙龈纤维性增生和体积增大，导致牙龈增生的药物主要有抗惊厥药、免疫抑制剂、钙离子通道阻滞剂。硝苯地平是钙离子通道阻滞剂的一种，广泛应用于治疗高血压、血管痉挛性心绞痛及某些心律不齐等冠心病，其导致牙龈增生的患病率为 6.3%～83%［2－6］，然而其具体机制尚未明确［7］。

有研究表明多肽类生长因子与增生性疾病的分子机制密切相关［8］，其中角质细胞生长因子(keratinocytegrowth factor，KGF)是调节间充质－上皮间相互作用的多肽［9］，通过与角质细胞生长因子受体(keratinocytegrowth factor receptor，KGFR)结合而发挥作用，并且在增生性病变组织的上皮增生中发挥一定的作用［10－11］。Olsen等分别对单层培养的牙龈成纤维细胞和牙龈角质形成细胞进行药物(硝苯地平、环孢菌素)处理，检测其对 KGF、KGFR表达的影响，结果表明KGF、KGFR在药物刺激下表达有所提高［12－14］，然而单层细胞培养的模式忽略了间充质－上皮间的相互作用。Dannewitz等首次采用永生化的牙龈角质形成细胞和牙龈成纤维细胞共培养，显示在环孢菌素导致牙龈增生中牙龈成纤维细胞起着决定性的作用，而永生化的牙龈角质形成细胞可能发生外源基因的表达、染色体改变以及表型改变等，不适合研究药物对牙龈上皮细胞的影响［15］。本文旨在建立原代培养的牙龈成纤维细胞与牙龈角质形成细胞共培养模型，以期在更接近于体内环境的条件下研究硝苯地平对KGF、KGFR表达的影响，探讨硝苯地平导致牙龈增生的可能机制。

1 材料和方法

1.1 主要材料和试剂

DMEM培养基、角质形成细胞培养液(Defined K－SFM)、新生牛血清(newborn calf serum，NCS)、胰蛋白酶、双抗(青霉素 100 U/L、链霉素100 μg/L)(Gibco，美国);DispaseⅡ (Roche，英国);硝苯地平(sigma－Aldrich，美国);细胞波形蛋白抗体、角蛋白抗体、SABC免疫组织化学染色试剂盒、DAB显色试剂盒(博士德，中国);MTT(methyl－thiazolyl－tetrazolium，四甲基偶氮噻唑盐，Sigma，美国);DEPC、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，Amresco，美国);人角质化细胞生长因子 ELISA 试剂盒(R＆D Systems，Abingdon，英国);TRIzol试剂(Invitrogen，美国);逆转录试剂盒、PCR反应试剂盒(Takara，日本);FITC标记的兔抗人KGFR抗体、FITC标记兔IgG抗体(北京博奥森生物技术有限公司);聚乙二醇400(南京古田化工有限公司);无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司);Millicell悬挂式细胞培养小室(Millipore)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

牙龈组织标本来源于2009－2010年在江苏省口腔医院口腔颌面外科和牙周科就诊的行阻生牙拔除术以及牙冠延长术的病人。所有病人均未服用导致牙龈增生的药物，未见牙龈增生的临床表现。所有操作均告知病人并取得了病人的知情同意。

牙龈角质形成细胞(gingival keratinocytes，GKs)的培养:将正常牙龈组织在2 U/mL的dispaseⅡ中4℃消化16～18 h后撕下上皮层，置消化液中(含 2.5g/L 胰酶、0.2g/L EDTA)37℃ 消化15 min，用100 mL/L新生牛血清的PBS终止消化，吹打，静置取上清，剩余组织块再用上述消化液消化15 min，重复2次。将最后收集的细胞上清1 000 r/min离心5 min收集细胞，用角质形成细胞培养液K－SFM重悬，接种于6 cm培养皿中，37℃、50 mL/L CO2培养箱中培养。每3d换液1次。牙龈成纤维细胞(gingival fibroblasts，GFs)培养:将撕下上皮后的牙龈结缔组织均匀剪碎，按照组织块法进行培养，孵育2～4 h后加入DMEM完全培养基(含100 mL/L新生牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素)进行培养，5～7d后首次换液，以后每3d换液1次［16］。

1.2.2 细胞鉴定

取生长良好的第2代细胞接种于置有盖玻片的6孔板中，待细胞汇合达80%时，弃去培养液，PBS轻轻清洗3次，用40g/L多聚甲醛固定细胞30 min，1g/L Triton－X－100 渗透细胞膜 15 min，PBS清洗5 min，3次;30 mL/L过氧化氢液浸泡30 min，蒸馏水清洗1～2次;滴加50 mL/L BSA封闭液，室温20 min，甩去多余液体;滴加1∶200稀释的一抗(波形丝蛋白抗体或角蛋白抗体)，37℃孵育1 h，PBS清洗2 min，3次;滴加二抗(即用型)2滴，37℃孵育20 min，PBS清洗2 min，3次;滴加试剂 SABC，37℃孵育 20 min，PBS清洗 5 min，4次;取DAB显色试剂A液、B液、C液各1滴，混合于1 mL蒸馏水中，混匀后滴加至孔中。室温显色，镜下控制反应时间1～10 min，蒸馏水洗涤。滴加苏木素数秒复染，洗涤;空白对照组加入PBS代替一抗，其他步骤相同。镜下观察进行细胞鉴定。

1.2.3 硝苯地平溶剂的选择

用体积分数分别为 2、5、7、10、15、20 mL/L 的DMSO以及聚乙二醇400、无水乙醇的培养液溶解硝苯地平培养GFs，分别采用MTT法、流式细胞仪检测其对GFs增殖和凋亡的影响。

1.2.4 GFs－GKs共培养模型的建立

GFs－GKs共培养参照参考文献［15］并进行了改进，采用孔径为1 μm的小室建立共培养模型，在上室培养GFs，下室培养GKs。首先将GKs接种于6孔板中，待细胞接近融合时，再将24 h前接种的GFs(8万/小室)的共培养小室移至6孔板里，两种细胞可以通过共同培养相互影响。共培养采用的培养液为K－SFM培养液。

1.2.5 硝苯地平对GF－GK共培养体系KGF－KGFR表达的影响

1.2.5.1 RT－PCR 分析 KGF 和 KGFR mRNA 的表达

分别用含硝苯地平终浓度为 0、0.2、20 μg/mL的培养液处理共培养系统3d，分别用TRIzol收集GFs、GKs，提取细胞总 RNA，反转录后进行 PCR。PCR产物经20g/L琼脂糖凝胶电泳后，在透射式紫外照射仪下观察结果。使用SYNGENE凝胶成像分析系统，对扩增产物的电泳条带进行灰度扫描，分析测定积分吸光度值，并分别计算KGF、KGFR mRNA RT－PCR产物与内参gAPDH mRNA RT－PCR产物的吸光度值之比(相对灰度值)。引物设计由上海生工生物技术有限公司合成(表1)。

1.2.5.2 ELISA 分析 KGF 蛋白表达

分别用含硝苯地平终浓度为0、0.2、20 μg/mL 的培养液处理共培养系统3d，收集培养上清液，按照ELISA试剂盒的说明操作，检测KGF的表达情况。

1.2.5.3 流式细胞仪检测KGFR表达

分别用含硝苯地平终浓度为 0、0.2、20 μg/mL的培养液处理共培养系统3d，收集各组细胞，细胞洗液洗涤2次后分别加入FITC标记的兔抗人KGFR抗体，设立同型对照，同型对照管中加入FITC标记兔IgG作为阴性对照;待测管中加入荧光标记的一抗，作为实验管，各加100 μL(一抗1∶20稀释)混匀即可。室温孵育20 min，加入细胞洗液，1 200 r/min低温离心10 min，反复2次。去除上清，控干，加入固定液0.2 mL，混匀。流式细胞仪检测。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 细胞形态学观察和鉴定

牙龈成纤维细胞来源于牙龈结缔组织，呈长梭形，纤维样，免疫细胞化学检测结果为波形纤维蛋白阳性，角蛋白阴性。牙龈角质形成细胞来源于牙龈上皮，细胞为多角形，融合呈典型的“铺路石”外观，免疫细胞化学检测结果为角蛋白阳性，波形纤维蛋白阴性。本研究采用3～6代的牙龈成纤维细胞、第3代的牙龈角质形成细胞进行实验。

2.2 硝苯地平溶剂的确定

体积分数为2 mL/L的DMSO、聚乙二醇400、无水乙醇对GFs的增殖与凋亡均没有影响，因硝苯地平易溶于DMSO，2 mL/L的DMSO能有效地将硝苯地平分散到培养液中，本研究确定体积分数为2 mL/L的DMSO为硝苯地平的溶剂。

2.3 GFs－GKs共培养模型的建立

孔径为1 μm的小室透明度高，不影响在显微镜下观察细胞的生长状态。含血清的培养液能显著改变角质形成细胞形态，促进分化，使细胞老化［17－18］。本研究采用 K－SFM 培养液，在共培养的情况下，GFs的生长良好，形态无改变，培养3d后增殖明显。

2.4 硝苯地平对GKs－GFs共培养体系中KGF、KGFR表达的影响

2.4.1 RT－PCR 分析 KGF、KGFR mRNA 的表达

GFs－GKs共培养 3d，分别检测gFs中 KGF、GKs中KGFR的mRNA的表达。随着硝苯地平浓度的升高，两种基因的表达量均上调(图1～2)。0、0.2、20 μg/mL 硝苯地平处理下的gFs 中 KGF的相对灰度值分别为 0.147 ±0.062、0.387 ±0.025、0.613 ±0.028，两者之间的差异均有统计学意义(P＜0.05)。GKs中KGFR的相对灰度值分别为 0.040 ±0.013、0.16 ±0.029、0.452 ±0.098，三者之间的差异均有统计学意义(P＜0.05)。

图1 共培养条件下，硝苯地平对牙龈成纤维细胞KGF基因表达的影响

2.4.2 ELISA 分析 KGF蛋白表达

GKs－GFs共培养3d，检测培养液中KGF的含量，随着硝苯地平浓度的升高，培养液中KGF含量增加。对照组培养液中 KGF水平为(125.57±8.89)ng/L，0.2、20 μg/mL 硝苯地平处理组培养液中 KGF 含量分别为(226.60 ±14.64)ng/L、(448.50 ±36.70)ng/L，三者之间的差异均有统计学意义(P ＜0.05)。

图2 共培养条件下，硝苯地平对牙龈角质形成细胞KGFR基因表达的影响

2.4.3 流式细胞仪检测KGFR表达

GKs存在 KGFR 基础表达，0.2 μg/mL 硝苯地平处理组膜KGFR蛋白表达量上调，而20 μg/mL硝苯地平处理组膜KGFR蛋白表达量下降(图3)，每个样品重复3 次。0、0.2、20 μg/mL 硝苯地平处理下的GKs中KGFR荧光阳性率分别为9.02 ±1.74、12.75 ± 0.86、5.54 ± 0.92，三者之间的差异均有统计学意义(P＜0.05)。

图3 共培养条件下，硝苯地平对牙龈角质形成细胞膜受体KGFR的影响

3 讨论

硝苯地平是一种有效的钙离子通道拮抗剂，它通过抑制心脏、血管平滑肌细胞外钙离子的内流，扩张周围血管和冠状动脉，降低高血压，防止痉挛，减少心肌耗氧量。1984年开始有学者报道硝苯地平导致的牙龈增生的病例［19］，然而迄今为止硝苯地平导致牙龈增生的机制仍不明确。

对于药物性牙龈增生的研究主要有临床研究和实验研究两方面。临床研究侧重于对危险因素的明确，实验研究侧重对牙龈增生分子机制的探究。实验研究主要有体内、体外实验两种方式。目前研究药物性牙龈增生的体外实验多局限在单层细胞的处理上，这个简单的细胞系统忽略了牙龈上皮与间充质结缔组织的相互作用，而牙龈上皮的形态和生理功能的维持需要间充质、上皮的相互作用。间充质－上皮细胞的相互作用实际上存在于每一个器官，是最常见的不同细胞间的相互作用方式之一。有研究表明胚胎发育上皮细胞的生长和分化经相邻的间充质细胞的直接调节，在成体组织中经相邻的间质维持。上皮细胞对间充质细胞的反馈能力以及他们之间的交流同样重要，间充质细胞和相邻的上皮细胞通过产生旁分泌因子调节细胞功能［20］。因此，不能排除成纤维细胞与角质形成细胞的相互影响在药物导致牙龈增生的过程中起着重要作用。Yang等从人良性前列腺增生组织获得成纤维细胞和上皮细胞，分别进行单独培养和共培养，发现两种状态下有110个基因表达有差异，得出上皮和间充质细胞间交互作用和交流在良性前列腺增生中起着重要的作用的结论，上皮细胞和成纤维细胞对生理以及病理的改变通过互相作用动态调节不同基因的表达［21］。

成纤维细胞能分泌不同的生长因子调节上皮细胞的行为，其中角质细胞生长因子是成纤维细胞生长因子家族中的成员，由间充质来源的细胞产生并且以旁分泌的方式通过特异的受体(即酪氨酸激酶角质细胞生长因子受体KGFR)发挥作用［22］。KGFR是在上皮细胞上表达的成纤维细胞生长因子受体－2的剪切变体。KGF能够诱导各种上皮细胞增殖、迁移以及基质金属蛋白酶的分泌。硝苯地平导致牙龈增生的特点之一为上皮表层轻度到中度过角化，棘层明显增厚，管状伸长的上皮钉突几乎垂直伸人结缔组织。KGF－KGFR的表达在这一病理过程中可能起着一定的作用。

本研究采用原代培养的牙龈成纤维细胞和牙龈角质形成细胞共培养，经硝苯地平处理后检测KGF、KGFR的表达。KGF在基因转录水平和蛋白表达水平以及KGFR在基因转录水平与前人的研究结果一致［12－14］，即与硝苯地平能导致gFS表达KGF显著增高，且呈浓度依赖性。然而流式细胞术检测角质形成细胞膜上受体－KGFR的结果却与前人不吻合，并且与其在基因转录水平上的改变也不一致［14］。这种不一致的原因可能是因为KGF与KGFR特异性结合后.以有活性的复合体的方式先后被转运到早期核内体、晚期核内体、溶酶体，然后内在化的KGFR以慢的动力学被降解［23］。流式细胞检测前，牙龈角质形成细胞没有经渗透处理，仅能检测到膜上KGFR。共培养体系中，牙龈成纤维细胞在硝苯地平处理下，KGF分泌量增多，与牙龈角质形成细胞上受体结合，继而转运至细胞内降解。硝苯地平刺激牙龈角质形成细胞表达KGFR虽有上调，但小于转运入胞降解的量是这一现象的可能解释，具体机制尚待进一步研究。综合考虑，细胞共培养与单层培养相比，考虑了细胞间的交互作用，部分还原了体内环境，更能如实反映药物对细胞的影响，有利于进一步阐明药物导致牙龈增生的机制。

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mechanisms of nifedipinl－induced hyperplasia:in volvment of KGF and KGFR

DI Chang－ping，SUN Yin，LI Lu，XU Yan
(Institute of Stomatology，Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China)

AIM:To explore the possible mechanisms of nifedipine－inducedgingival hyperplasia in agingival fihrohlasts andgingival keratino－cytes co－culture system.METHODS:Gingival fibroblasts(GFs)and keratinocytes(GKs)were isolated and cocultured.Withdifferent concentrations(0，0.2，20 μg/mL)of nifedipine treatment on the coculture system，the expression of keratinocytegrowth factor(KGF)and keratinocytegrowth factor receptor(KGFR)mRNA were examined by reverse transcriptase PCR(RT－PCR)，while the secretion of KGF and the expression of KGFR on the membrane were analyzed by ELISA and flow cytometry，respectively.RESULTS:Under the coculture condition，the expression of KGF ingFs was significantly increased by nifedipine in adose－dependent manner.Moreover，the expression of KGFR mRNA ingKs was upregulated，and the level of KGFR protein on the membrane was increased when the concentration of nifedipine was 0.2μg/mL.CONCLUSION:The KGF－KGFR pathway of mesenchymal－epithelial interaction plays an important role in the mole cular mechanism of nifedipine－inducedgingival hyperplasia.The in vitro coculture model which mimics the in vivo condition can be ofgreat benefit to further study the mechanisms ofgingival hyperplasia.

nifedipine;gingival hyperplasia;coculture;KGF;KGFR

R781.4

A

1005－2593(2011)01－0014－06

2010－10－08

狄昌萍(1984－)，女，汉族，江苏人。硕士生(导师:徐艳)

徐艳，E －mail:Yanxu@njmu.edu.cn

·综述·