董正谋，刘鲁川，安建平，刘 宁，刘 锐，周 霞，叶丽君

(第三军医大学大坪医院野战外科研究所口腔科，重庆 400042)

复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星牙周缓释制剂对大鼠睾丸的毒性

董正谋，刘鲁川，安建平，刘 宁，刘 锐，周 霞，叶丽君

(第三军医大学大坪医院野战外科研究所口腔科，重庆 400042)

目的:观察复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星牙周缓释制剂对大鼠睾丸超微结构和氧化损伤指标的影响。方法:40只SD雄性大鼠按随机数字表法分为阴性对照组和低、中、高剂量组，每组10只;低、中、高剂量组每日按体质量(1、4、8g/kg)灌服复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星牙周缓释制剂，阴性对照组每日按体质量灌服双蒸水，连续42d，与雌鼠交配成功后处死雄鼠，计算睾丸、附睾系数，进行精子计数和活动度检查，睾丸行超微结构观察，并检测睾丸中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力。结果:高剂量组睾丸、附睾系数减小，精子数量减少、活动度降低，与阴性对照组比较均有统计学意义(P＜0.05)，高剂量组睾丸超微结构有损伤;中剂量组睾丸MDA含量上升、CuZn－SOD活力降低，高剂量组睾丸 MDA含量上升、Mn－SOD活力和CuZn－SOD活力下降，与阴性对照组比较均有统计学意义(P＜0.05)。结论:高剂量复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星牙周缓释制剂对大鼠睾丸有一定的毒性，MDA含量升高、SOD活力下降可能是其作用机制之一。

牙周缓释制剂;睾丸;超微结构;氧化损伤

［牙体牙髓牙周病学杂志，2011，21(1):19］

［Chinese Journal of Conservativedentistry，2011，21(1):19］

牙周病是口腔疾病中的常见病和多发病，严重影响人类健康。抗生素是牙周病治疗的重要手段，将其局部应用于牙周已成为一种全新、有效的给药途径，复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星牙周缓释制剂是其中的代表之一。本研究在一定时期内对雄性大鼠灌服复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星牙周缓释制剂，观察该制剂对大鼠睾丸的毒性，为进一步的临床研究提供依据。

1 材料和方法

1.1 主要材料和仪器

复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星牙周缓释制剂(0.01g/枚，自制);MDA 测试盒、SOD 测试盒(南京建成生物工程研究所);冰醋酸(重庆川东化工有限公司化学试剂厂)。TECNAI－10透射电子显微镜(飞利浦公司，荷兰);Eb－280M电子天平(libror公司，日本);高速低温离心机(贝克曼公司，美国);全波长酶标测定仪(赛默飞公司，美国);7200可见光分光光度计(Unic公司，美国);420型三用恒温水浴箱(江苏国胜实验仪器厂)。

1.2 动物分组和给药

取体质量(200±20)g的11～13周龄SPF级SD雄性大鼠40只［第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心，合格证号:SCXKC(渝)2007－0005］。适应性饲养1周，观察一般情况，无异常后按随机数字表法分为阴性对照组和低、中、高剂量组，共4组，每组10只分笼喂养。饲养条件:清洁级动物房，温度(22±3)℃，相对湿度50%～60%，人工照明，12 h光照，12 h黑暗，食用标准颗粒饲料，自由饮水。

低、中、高剂量组每日按体质量1、4、8g/kg(折合原料药 0.1、0.4、0.8g/kg，相当于临床成人全口牙用量的156.25、625、1 250倍)的剂量经胃灌服复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星牙周缓释制剂，阴性对照组经胃灌服相应体积双蒸水，每天1次，连续42d，然后与同组平行喂养的SD雌性大鼠(其来源、饲养条件同SD雄性大鼠)交配，交配成功后处死雄鼠，观察大鼠睾丸的毒性。

1.3 检测指标和方法

1.3.1 睾丸、附睾系数和精子计数的观察

大鼠处死后解剖，仔细分离睾丸、附睾，称重后按以下公式计算其系数:睾丸(附睾)系数=双侧睾丸(或附睾)质量(g)/体质量(g)×100。精子计数观察:取附睾置2 mL 37℃生理盐水中剪碎，混匀，制成精子悬液，吸精子悬液移入离心管中，置60～80℃水浴使其死亡，取悬液1滴，滴入血细胞计数板，计数精子数。

1.3.2 精子活动度观察

按精子计数相同的方法迅速制备精子悬液，将悬液放在37℃水中孵育15 min，室温(26℃)下10 min内完成200个精子的活动度分级，精子活动度分为:A级(快速前向运动)、B级(慢速前向运动)、C级(非前向运动)、D级(不活动)。

1.3.3 睾丸超微结构观察

大鼠麻醉后在冰台上滴加4℃25 mL/L戊二醛固定液，打开腹腔，迅速取出睾丸，以锐利薄刀片快速将睾丸切割成1 mm×1 mm×1 mm的组织块，置4℃ 25 mL/L戊二醛固定液中浸泡固定，常规制作透射电镜标本，在透射电子显微镜下观察睾丸超微结构。

1.3.4 睾丸氧化损伤指标的观察

将大鼠睾丸去被膜、脂肪和血管，准确称其质量，加9倍体积的生理盐水，用玻璃匀浆器在冰浴条件下研磨6 min制成睾丸匀浆，然后在低温(4℃)下以2 000 r/min离心15 min，静置片刻，取上清液，分别按相应试剂盒说明测定蛋白含量、MDA含量和SOD活力。

1.4 统计学分析

用SPSS13.0软件对数据进行单因素方差分析，两两比较用 LDS－t检验，检验水准 α=0.05。

2 结果

2.1 睾丸、附睾系数和精子计数的观察

高剂量组睾丸系数和附睾系数显著减小、精子计数明显下降，与阴性对照组比较均有统计学差异(P＜0.05)，其余组间比较无统计学差异(P ＞0.05)(表1)。

表1 睾丸、附睾系数和精子计数的观察 (n=10)

2.2 精子活动度观察

高剂量组A、B级精子数目减少明显，C、D级精子数目增加显著，与阴性对照组比较均有统计学差异(P＜0.05)，其余组间比较无统计学差异(P ＞0.05)(表 2)。

表2 精子活动度观察 (n=10)

2.3 睾丸超微结构观察

透射电镜见曲细精管内含不同发育阶段的生精细胞，核大而致密，连接紧密;支持细胞含较多细长线粒体，滑面内质网丰富，高尔基复合体发达;间质细胞常染色质明显，可见脂滴、线粒体，内质网呈同心环状，低、中剂量组与阴性对照组基本相同。高剂量组生精上皮排列紊乱，连接疏松，细胞间隙增大;支持细胞线粒体肿胀，滑面内质网数目减少;间质细胞异染色质明显，线粒体质膜皱缩，内质网稀疏，溶酶体增多(图1)。

图1 睾丸超微结构观察

2.4 睾丸氧化损伤指标的观察

中剂量组MDA含量升高、CuZn－SOD活力降低，高剂量组MDA含量升高、Mn－SOD活力和Mn－SOD活力下降，与阴性对照组比较均有统计学差异(P＜0.05)，其余组间比较无统计学差异(P ＞0.05)(表 3)。

表3 睾丸氧化损伤相关指标的观察(n=10，±s)

表3 睾丸氧化损伤相关指标的观察(n=10，±s)

*与阴性对照组比较P＜0.05

组别MDA Mn－SOD CuZn－SOD阴性对照组1.52 ± 0.27 102.71 ±24.98 191.47 ±11.20低剂量组 1.64 ±0.41 91.09 ±22.73 189.29 ±19.46中剂量组 2.99 ±0.51* 96.45 ±21.61 149.89 ±12.25*高剂量组 3.63 ±0.46* 78.99 ±31.01* 130.31 ±19.01*

3 讨论

牙周病是一种病因复杂的微生物感染性疾病，主要以G－菌和厌氧菌感染为主，牙周致病菌直接或间接损伤牙周组织，还激发宿主的炎性免疫反应［1］，严重影响人类的生理和心理健康。一些研究还指出:牙周病与心血管疾病［2］、糖尿病［3］、消化系统疾病、类风湿、生殖和妊娠［4－5］等密切相关。相对于抗生素的全身应用、局部涂布、漱口和冲洗，局部抗菌缓控释制剂有着明显的优势［6］，复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星牙周缓释制剂是根据牙周病的发病机制并结合缓控释制剂的优点而研制的新药，本实验通过观察该药对雄性大鼠睾丸的毒性，为进一步的临床研究提供依据。

睾丸和附睾为雄性生殖系统最主要的器官，睾丸是精子发生、分化和增殖的场所，附睾为精子的继续成熟、贮存提供适宜的环境，睾丸系数和附睾系数反映了生殖器官的质和量，是评价药物毒性的重要指标之一［7］;本研究显示高剂量组睾丸系数和附睾系数减小，说明高剂量的制剂及其代谢产物对睾丸和附睾的结构和功能产生一定的影响，由此而导致其质量减轻，系数减小。本研究还发现高剂量组精子数量明显减少，说明高剂量的制剂抑制了生精上皮的发生、分化和增殖、成熟等相关过程，导致精子数量产生不足，数量减少。

活动性能是成熟精子的重要标志，活动度是精子活动质量高低的敏感性指标［8］。以往研究表明奥硝唑可引起精子活动能力下降［9］，本研究结果表明高剂量制剂A、B级精子数目明显减少，C、D级精子数目显著增加，说明具有高活动能力的精子数目减少，而低活动能力的精子数目增多，精子活动质量受影响，提示高剂量的制剂及其代谢产物可能引起了睾丸和附睾的细胞代谢异常和功能障碍，导致某些物质合成增加或减少，能量生成或转换障碍，影响精子动力机构，导致活动性能降低。

正常的形态学是组织功能的基础:睾丸是一种分化、发生活跃的组织，除含有一般的细胞器外，其线粒体、内质网含量非常丰富，以保证精子的分化、发生和成熟［10］。睾丸超微结构显示高剂量组生精上皮层、间质细胞和支持细胞均有不同程度的改变，说明了这些细胞器的功能受到影响:线粒体损伤时可引起能量代谢障碍;滑面内质网肿胀，合成、转化类固醇激素的功能降低，并且生物转化和解毒作用下降，可进一步造成细胞损伤［11］，这些损伤导致了生精上皮分化和增殖功能降低，精子活动能力下降，同时支持细胞的营养、支持作用减弱，间质细胞局部调节作用降低，精子生存微环境受影响。

当外源性刺激物进入机体后，机体可通过酶和非酶系统产生氧自由基，如O2－、OH、H2O2、HOCl、NO、O3和单线态氧等，这些物质能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化形成脂质过氧化物如醛基(如MDA)等，脂质过氧化物不仅把活性氧转换成活性化学剂，产生链式或链式支链反应放大活性氧的作用;而且通过脂氢过氧化物分解，引起细胞代谢异常和功能障碍，甚至导致细胞死亡［12］，因此MDA含量可反映细胞脂质过氧化损伤的程度。奥硝唑对睾丸具有一定的毒性作用:Pang XB等认为奥硝唑引起精子活动能力的下降与MDA生成量增加有关［13］。本研究显示随着药物剂量的增加，MDA含量也增加，中、高剂量组MDA升高明显，与前人的研究一致，说明睾丸组织中活性化学剂和脂氢过氧化物含量升高，引起细胞膜脂质过氧化，细胞代谢异常，功能受损，精子增殖、成熟和能量合成障碍，其数目减少、活动性能降低。

当氧自由基产生时，机体可通过酶和非酶抗氧化系统清除过多的氧自由基，SOD是其中最主要的代表，可清除超氧阴离子自由基，以减少对细胞的损伤，SOD活力的高低反映了机体清除氧自由基的能力［14］。组织内存在两种SOD:Mn－SOD表达在线粒体中，是歧化线粒体生成的主要抗氧化酶;CuZn－SOD定位于胞浆，Cu参与酶活性中心结构，并传递电子，Zn则有支持稳定作用［15］。本研究显示中剂量组CuZn－SOD活力和中、高剂量组Mn－SOD活力、CuZn－SOD活力均有不同程度的下降，说明机体清除氧自由基能力下降，细胞呼吸链相关酶类、电子载体等合成、传递受阻，线粒体歧化生成减少，能量转换障碍，胞浆中酶活性中心结构不稳定，物质代谢受影响，继而造成代谢异常和功能紊乱，甚至发生形态学的改变。

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The testicular toxicity of ornidazole and pefloxacin mesylate containing，sustained－release periodontaldrug on SD male rats

DONG Zheng－mou，LIU Lu－chuan，AN Jian－ping，LIU Ning，LIU Rui，ZHOU Xia，YE Li－jun
(Department of Stomatology，Institute of Field Surgery，Daping Hospital，the Third Military Medical University，Chongqing 400042，China)

AIM:To investigate the testicular toxicity of a ornidazole and pefloxacin mesylate containing，sustained－release periodontal compound on male rats.METHODS:A total of 40 male SD rats were randomlydivided into negative control，low－，medium－and high－dosegroups by randomdigits table，with 10 animals in eachgroup.The rats of low－，medium－and high－dosegroups were feddaily with the sustained releasedrug at 1，4，and 8g/kg respectively，and those of the negativegroup were feddaily withdistilled water，for 42 consecutivedays.Then all rats were killed after success mating.The coefficient of testis and epididymis，sperm count and movement，testicular ultrastructure，malondialchehyche(MDA)content and superoxidedismutase(SOD)activity in testis weredetermined.RESULTS:Coefficient of testis and epididymis，sperm counting and sperm mobility were significantly reduced in high－dosegroup(P ＜0.05).In addition，ultrastructuraldamage was observed.In both medium－dose and high－dosegroups，MDA content increase and CuZn－SOD activitydecrease were significant(P ＜0.05).But significant Mn－SOD activitydecrease wasdetected only in high－dosegroup(P ＜ 0.05).CONCLUSION:The sustained－release，ornidazole and pefloxacin mesylate containing，periodontal compound has certain testis toxicity.The underlying mechanism might be the increased MDA content anddecreased SOD activity.

Sustained－release periodontal preparation;testis;ultrastructure;oxidativedamage

R781.4

A

1005－2593(2011)01－0019－05

2010－08－13;

2010－12－08

重庆市科技攻关计划项目(CSTC 2009AC5019)

董正谋(1973－)，男，汉族，湖北红安人。硕士生(导师:刘鲁川)，主治医师

刘鲁川，E －mail:LiuLuchuan1957@126.com

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