邓西川 黄 伟 戴 维 胡晓莉 沈旭东 杨致邦*

（1 重庆医科大学基础医学实验教学中心病原生物学与免疫学实验室，重庆 400016；2 西南大学荣昌校区动物医学系，重庆 402460；3 重庆医科大学临床医学五年制2007级4班，重庆 400016）

大量研究已经表明，幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，HP）是人类常见的感染病原之一，是多种胃疾病的生物致病因素，也是发生胃癌的重要危险因素，世界卫生组织已将其列为第一类生物致癌因子[1]，防治HP感染具有重要的临床意义。

近年来，许多研究已经证实口服卵黄免疫球蛋白（immunoglobulin yolk，IgY）可通过被动免疫有效防治胃肠道感染性疾病[2,3]，但在胃内，由于受到高酸性和高胃蛋白酶的生态环境的影响，使其应用受到限制。提高IgY对酸和蛋白酶的耐受性对口服IgY的开发具有重要意义。硫糖铝（sucralfate）作为抗消化性溃疡的制剂已在临床广泛应用。该药对胃黏膜具有黏附性，可与许多大分子物质如黏液、糖脂蛋白等结合；并可与胃黏膜表面的黏液结合形成复合的胶状物，起到黏膜保护作用[4]。

HP在胃内定植的关键环节是黏附，其黏附素（Helicobacter pylori adhesin A，HpaA）具有黏膜结合特性，由黏附素受体系统介导与宿主细胞发生特异性黏附，从而使HP定植于胃内[5]。本文制备抗HP的重组HpaA特异性IgY，将适当比例的硫糖铝加入HpaA IgY中，以提高HpaAIgY对酸和蛋白酶的耐受性，通过体外试验评价硫糖铝对HpaA IgY的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

H.pylori重组菌DH5α-hpaA-pQE30为本实验室构建[6]并保存，Ni2+-NTA亲合层析柱为Qiagen公司产品；30周龄立克体鸡由西南农业大学荣昌分校生物中心提供，常规饲养；HRP标记的羊抗鸡IgG、羊抗人IgG购自Southern Biotech公司；检测血中抗HP特异性IgG的Western blot试剂盒购自上海元谷科技发展公司；HP选择培养基、LA培养基、ELISA试验中的抗原包被液、酶稀释液、显色剂等为本室配制；HpaA（+）血清为本实验室从HP阳性的患者血清筛选；胃蛋白酶购自Amresco公司产品；硫糖铝混悬液购自上海旭东海普制药公司。

1.2 方法

1.2.1 制备重组HpaA抗原

将表达菌DH5α-hpaA-pQE30接种于LA培养基中，37℃振摇培养16h。再转种于LA培养基中，37℃培养至细菌浓度达到A600＝0.6时，用1mmol/L的IPTG诱导表达4h；再将菌液4℃、8500r/min离心10min；收集沉淀物超声碎菌，4℃、8500r/min离心45min；加入包涵体裂解液裂解2h，4℃、8500r/min离心45min，取上清液，用Ni2+-NTA树脂亲和层析纯化。纯化物用12%SDS-PAGE分析，用Bradford法测定纯化物的蛋白含量；用Western blot鉴定重组蛋白的抗原性；将重组蛋白免疫家兔，用间接ELISA法检测其血清的抗hpaA效价以鉴定其免疫原性；-70℃保存备用。

1.2.2 制备抗重组HpaA的IgY

以纯化的重组hpaA为抗原，参照黄进等[7]的方法，将重组hpaA与等量完全弗氏佐剂充分研磨乳化后接种洛曼母鸡[6]。初次接种剂量为100µg/只；15d后进行第2次接种，200µg/只；以后每隔1个月进行一次加强免疫，计量为300µg/只，共接种2次。在末次接种后1周开始收集鸡蛋，取出蛋黄液混合后，先用水稀释，再用氯仿粗提hpaAIgY，饱和硫酸铵法纯化，最后过滤除菌。纯化蛋白用12%SDS-PAGE分析，Bradford法测定IgY蛋白含量，间接ELISA法测定hpaAIgY效价，-20℃保存。

1.2.3 强酸下硫糖铝对HpaAIgY的保护作用观察

参照Kyong AL[8]的方法，用pH值分别为1.5、2.0、3.0的磷酸二氢钠缓冲液将hpaA IgY稀释后，分别加入10%～60%的硫糖铝（体积百分比），使IgY终浓度为1mg/mL；37℃维持2h后，立即加入适量的NaOH（2mol/L）中和，将pH值调至7.0，ELISA法测定IgY的A450值。将含1mg/mL pH7.0的IgY稀释液37℃维持2h作为参照，以IgY试验液的A450值与参照IgY的A450值之比测算IgY的剩余抗体活性，用（AR/AC）%表示。与同样条件处理但未加硫糖铝的IgY液为对照，评价硫糖铝对hpaA IgY的保护作用。

1.2.3.1 硫糖铝对胃蛋白酶裂解HpaAIgY的保护作用观察

参照Kyong AL[8]的方法，用pH 2.0、pH 3.0的磷酸二氢钠缓冲液将hpaA IgY稀释后，分别加入终浓度为0.02mg/mL的胃蛋白酶，再分别加入10%、30%、50%的硫糖铝，使IgY终浓度为1mg/mL；37℃维持4h，立即加入适量的NaOH（2mol/L），将pH值调至7.0，ELISA法测定IgY的A450值。以同样条件处理的未加胃蛋白酶和硫糖铝，pH7.0含1mg/mL的hpaA IgY稀释液作参照，并按前述方法计算其剩余抗体活性。以同样条件处理加胃蛋白酶未加硫糖铝的IgY液为对照，评价硫糖铝对胃蛋白酶裂解hpaA IgY的保护作用。

1.2.3.2 反复冻融下硫糖铝对特异性IgY的保护作用

用pH7.0的磷酸盐缓冲液稀释hpaA IgY，再分别加入10%、30%、50%的硫糖铝，使IgY的终浓度为1mg/mL，4℃反复冻融7次，每次间隔1h；以未冻融处理、未加硫糖铝、在4℃存放的同样稀释度的IgY为参照，ELISA法检测IgY的A450值，并按前述方法计算其剩余抗体活性。以同法处理的不加硫糖铝的IgY液为对照，评价在反复冻融条件下硫糖铝对hpaA IgY的保护作用。

2 结 果

2.1 重组hpaA抗原的制备

表达的重组hpaA蛋白经SDS-PAGE后凝胶扫描图象软件分析，破碎菌的上清与沉淀在相对分子质量30000处均可见明显的外源蛋白的表达带，约占全菌的70%。经纯化后可见单一条带，纯度达90%以上，见图1。Bradford法测定重组蛋白含量为1.08mg/mL。Western blot鉴定在相对分子质量30000处出现相应的条带，大小与预期的一致（图2）。ELISA法测得免疫后兔抗血清与VacA抗原反应的效价为1∶1280。

图1 重组HpaA蛋白表达的SDS-PAGE分析

图2 重组HpaA蛋白的Western blot分析

2.2 抗重组hpaA特异性IgY的制备

蛋黄液纯化浓缩后，测得其hpaA IgY的蛋白含量为6.4mg/mL；经SDS-PAGE分析，在相对分子质量65000和25000处分别可见两条条带，与IgY重链和轻链的分子质量相符（图3），IgY的两重链及两轻链之和与总相对分子质量180×103相符合。凝胶扫描图象软件分析其纯度为72.0%。ELISA法测得I其效价为1∶12800。

2.3 各种保护作用的观察

2.3.1 强酸下硫糖铝对特异性IgY的保护作用

在强酸条件下，加入硫糖铝后抗体活性明显提高，并随硫糖铝浓度增高而提高。在pH 1.5条件下，未含硫糖铝的hpaA IgY的抗体活性仅能维持30.5.%；含30%硫糖铝的IgY的剩余抗体活性为35.4%，含50%硫糖铝的IgY可使剩余抗体活性提高到48.2%，含60%硫糖铝的IgY可使剩余抗体活性提高到65.8%。在pH 2.0条件下，未加硫糖铝之IgY剩余抗体活性为35.6%，含30%硫糖铝的IgY可使剩余抗体活性提高到85.4%，含50%的硫糖铝的IgY几乎可完全保持其抗体活性。在pH 3.0条件下，不加硫糖铝的IgY抗体活性能保持64.8%，30%硫糖铝即可使IgY抗体活性保持87.3%，而50%以上浓度的硫糖铝几乎可完全保持IgY的抗体活性（图4）。

2.3.2 硫糖铝对胃蛋白酶裂解特异性IgY的保护作用

在pH 2.0 、3.0和0.02mg/mL胃蛋白酶浓度条件下，加硫糖铝的hpaA IgY抗体的剩余活性随硫糖铝的浓度增高而提高。在pH 2.0 时，不加硫糖铝的IgY抗体的剩余活性为20.1%，含10%、30%、50%硫糖铝IgY的剩余活性分别为62.8%、71.6%、82.5%。在pH 3.0 时，不加硫糖铝的IgY抗体的剩余活性为42.4%，含10%、30%、50%硫糖铝IgY的剩余活性分别为75.6、87.4%、94.5%（图5）。与不加硫糖铝比较，差异有显著性（P＜0.01）。

图3 纯化后IgY的SDS-PAGE分析

图4 在pH 1.5、2.0和3.0条件下加入0%～60%硫糖铝hpaA IgY的剩余抗体活性

2.3.3 反复冻融下硫糖铝对特异性IgY的保护作用

经反复冻融后，未含硫糖铝的IgY的剩余抗体活性下降至62.4%，加入硫糖铝后，随所含硫糖铝浓度的增高，其剩余抗体活性也提高。含10%硫糖铝的IgY可使其剩余抗体活性提高到70.6%，含30%硫糖铝的IgY可使其剩余抗体活性提高到82.7%，50%硫糖铝可提高到89.3%（图6）。

图5 在pH 2.0、3.0和0.02mg/mL的胃蛋白酶条件下加入10%、30%和50%硫糖铝的hpaA IgY的剩余抗体活性

图6 反复冻融下硫糖铝对HpaA IgY的保护作用

3 讨 论

高酸性和含高浓度的胃蛋白酶是胃内生态环境最主要的特点。陈剑秋等[9]对健康成人胃内24h pH值的动态检测表明，胃内pH值的基线为（1.63±0.34），当进食时pH值升高，胃内食物排空后降至基线水平。正常成人胃内的胃蛋白酶浓度为0.02 mg/mL，胃蛋白酶作用的最适pH为1.5～2.2，最适温度为37 ℃左右。因此，防治HP感染的制剂在胃内必须耐受高酸性和高蛋白酶的作用才能奏效。

Kyong等[10]的报道表明，当pH＜3时，IgY的抗体活性可降低50%，在pH 2.0条件下4h，IgY几乎完全失活。在pH3.0条件下，加入30%山梨醇可显著提高IgY的稳定性，加入50%山梨醇可完全维持IgY的抗体活性。Xiao等[11]用壳聚糖-藻酸盐微胶囊包裹IgY，将胶囊置于pH3.0～6.0的模拟胃液中试验，其结果可使IgY活性维持到61.36%～74.61%。本文的结果表明，在IgY液中加入硫糖铝，可显著提高IgY在酸性环境中的稳定性，其保护作用明显优于糖类，也优于用壳聚糖-藻酸盐微胶囊包裹IgY。30%～50%硫糖铝可在胃内pH 2.0和含0.02mg/mL胃蛋白酶的模拟胃液环境中有效保护IgY的活性，提高IgY抗冻融力。

硫糖铝是一种含8个硫酸根的蔗糖硫酸酯铝盐（C12H30Al8O5lS8xAl（OH）3yH20），其硫酸蔗糖部分在碱性的氢氧化铝分子之间交联，为立体结构的桥形复合物，黏附性强，带负电荷，能与多种带正电荷的化学基团或大分子物质结合，如黏液、糖脂蛋白以及药物、金属等；也可与胃十二指肠黏膜表面的黏液结合，形成复合的胶状物，对黏膜起到保护作用[4,12]。硫糖铝遇酸解离之后，其氢氧化铝凝胶可发挥抗酸作用，不仅可缓解强酸环境，也可破坏胃蛋白酶作用的最适酸性环境。而且，硫糖铝本身可与胃蛋白酶络合，直接、持续地抑制胃蛋白酶的活性。用硫糖铝作为IgY的保护剂，不仅可降低胃酸和胃蛋白酶对IgY的破坏作用，还可发挥硫糖铝本身对胃黏膜的保护作用，是比较理想的IgY保护剂。因此，制备含硫糖铝的hpaA特异性IgY有望使IgY在胃内发挥更加有效的预防HP感染的作用。

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[8] Kyong AL,Sung KC,Yoon JL,et al.Acid stability of anti-Helicobacter pylori IgY in aqueous polyol solution[J].J Biochem Mol Biol,2002,35(5)：488-493.

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