黄雪琨 李源 刘红 张革化 徐伟杰

IL-1β对人鼻黏膜上皮细胞黏蛋白MUC5ACmRNA的表达的影响

黄雪琨 李源 刘红 张革化 徐伟杰

目的探讨IL-1β对鼻黏膜上皮细胞黏蛋白MUC5ACmRNA表达的影响。方法在培养的第二代人鼻黏膜上皮细胞加入IL-1β(10ng/ml)刺激24 h后，采用荧光定量巢式RT-PCR检测人鼻黏膜上皮细胞中MUC5AC mRNA的定量表达。结果在培养的鼻黏膜上皮细胞上检测到MUC5ACmRNA的表达，IL-1β刺激组MUC5ACmRNA定量表达［(4.60±1.89)108拷贝/μg］均高于对照组［(2.50±1.40)107拷贝/μg］，差异具有统计学意义(P＜0.05﹚。结论IL-1β诱导鼻黏膜上皮细胞中MUC5AC mRNA的表达增高，提示IL-1β可能具有上调鼻黏膜上皮细胞黏蛋白mRNA的表达的作用。

白细胞介素1β;黏蛋白;RT-PCR

黏蛋白是鼻腔鼻窦黏液的重要组成部分，决定着黏液的粘弹性。MUC5AC是主要的分泌型黏蛋白之一，已证实MUC5AC在慢性鼻-鼻窦炎筛窦黏膜中表达增高［1］，但黏蛋白MUC5AC的调节机制尚未明了。白介素1β(Interleukin-1beta，IL-1β)主要由活化的单核巨噬细胞产生，是一种重要的具有多种功能的前炎症细胞因子，在急性和慢性炎症中起重要作用，在CRS的上颌窦黏膜也检测到IL-1βmRNA表达增高［2］。本研究在培养的人鼻黏膜上皮细胞IL-1β刺激后，采用荧光定量巢式RT-PCR检测鼻黏膜上皮细胞黏蛋白MUC5ACmRNA表达，探讨IL-1β对黏蛋白MUC5ACmRNA表达的影响。

1 资料与方法

1.1 鼻黏膜上皮细胞原代培养和传代培养下鼻甲黏膜组织来自我科行鼻中隔手术患者(术前已征得患者同意)，近期无应用糖皮质激素、抗组胺及抗生素药物史，无阿司匹林耐受不良、无哮喘病史。胎牛血清培养基配方、无血清培养基配方、鼻黏膜上皮细胞原代培养和传代培养方法同前［3］。术中取下鼻甲黏膜组织放入胎牛血清培养基的无菌离心管。在无菌室超净工作台里，以无齿小镊将黏膜块夹到烧杯里，抗生素液(含100 IU/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的0.9%生理盐水)冲洗6～7遍，5 min/次。剪碎组织，加入0.1%胶原酶(Cibco公司)，量为组织块体积的5倍，37°消化30 min。离心1000 r/min 5 min，弃上清。沉淀中加入3 ml血清培养基，滴管吹打，加入培养瓶中，于37°5%CO2培养箱培养。培养24 h后吸取2/3的上清液弃去，更换为无血清培养基。原代培养第3天后，倒置显微镜观察，见大部分细胞贴壁，呈现鹅卵石隔日更换无血清培养基，放入37℃CO2培养箱。黏膜上皮细胞生长，汇合成片时则需要传代。以吸管吸去旧的培养液，加无菌Hanks液洗细胞两遍。加入0.25%胰蛋白酶约50 μl/ cm2，以恰好覆盖细胞为宜。在倒置显微镜下观察，当细胞质回缩，表示细胞脱落，90%细胞质回缩，细胞间隙增大后，轻轻吸去消化液，加入血清培养液，轻轻吹打，制成细胞悬液，以适当浓度种植到培养瓶中，置5%CO2培养箱中培养。培养24 h后更换为无血清培养基。

1.2 IL-1β刺激培养的鼻黏膜上皮细胞取第二代培养的鼻黏膜上皮细胞，台盼兰染色细胞活性＞95%，以5×105/ml转入6孔培养板中，进行无血清培养7～8 d后，上皮细胞接近完全融合。一组细胞加入含有IL-1β(Peprotech公司) 10ng/ml的无血清培养基(IL-1β刺激组，n=4)，另一组仅加入无血清培养基作为对照(对照组，n=4)。孵育24 h后采用荧光定量RT-PCR检测培养的鼻黏膜上皮细胞黏蛋白MUC5AC mRNA的表达。

1.3 荧光定量巢式RT-PCR

1.3.1 细胞RNA的提取直接往直径3.5 cm的培养板加TRIZol(Invitrogen公司)1 ml，溶解细胞，提取总RNA。置Eppendorf管，15℃～30℃孵育5 min，加入氯仿(0.2 ml氯仿/1 ml TRIZol)，盖紧盖子，用力摇动15 s，15℃～30℃孵育2～3 min，4℃12000 r/min离心15 min，取上清液至新的Eppendorf管，加异丙醇(0.5 ml异丙醇/ml TRIzol)，15℃～30℃孵育样品10 min，4℃12000 r/min离心10 min，弃上清液，75%乙醇洗涤沉淀一次(至少1 ml 75%乙醇/ml TRIzol)，4℃7500 r/ min离心5 min，弃乙醇，空气干燥5～10 min，加DEPC处理水溶解RNA，-80℃保存备用。若长期保存，加入2.5倍体积乙醇，置-80℃保存。

1.3.2 RNA样品鉴定利用紫外分光光度计(日本SHIMADZU UV mini 1240)上测定RNA样品在波长为260 nm时的吸光度值(A值)。总RNA质量浓度计算公式:质量浓度(g/L)=A260稀释倍数(120倍)40/1000。

1.3.3 逆转录反应取4 μl RNA模板做逆转录反应，仪器为PE9600PCR仪(美国Perkin Elmer公司)。反应体系如下: 5逆转录buffer 4 μl，上游引物(10pM/μl)0.4 μl，下游引物(10pM/μl)0.4 μl，dNTPs(25 mM)0.2 μl，MMLV(10U/μl)1 μl，DEPC水10 μl，RNA模板4 μl。总体积:20 μl。逆转录buffer成分:50 mM Tris-HCl(pH8.0)，50 mM KCl，4 mM MgCl2，10 mM DTT。反应条件:37℃1 h，然后95℃3分钟。

1.3.4 MUC5AC扩增引物及荧光探针(中山大学达安基因公司)上游引物(外引物)5'-TGA CGG ACC TGG ATG TGG T-3'。下游引物(外引物)5'-TGT CAT TCC CGT AGC AGT AGG A-3'。扩增片段180bp。上游引物(内引物)5'-TGC GTC CCA CGA CAT CTG-3。下游引物(内引物)5'-CAG GTG AAT GGG CAC ATG TG-3'。扩增片段63bp。荧光探针5'-FAM-ATC GAT TGG AGA GGC CGG ACC G-TAMRA-3'。

1.3.5 检测MUC5AC的样本按以下反应体系和反应条件进行用外引物进行定性PCR:样本按以下反应体系进行:5定性PCR buffer(美国ABI公司)5 μl，上游引物F(外) (10pM/μl)0.5 μl，下游引物R(外)(10pM/μl)0.5 μl，dNTPs (25 mM)(Sigma公司)0.4 μl，Taq酶(美国ABI公司)1.5 μl，cDNA 5 μl，ddH2O 12.1 μl，总体积:25 μl。PCR buffer成分: 10 mM Tris-HCl(pH8.0)，50 mM KCl，2 mM MgCl2。.反应条件为:93℃3 min;然后93℃1 min，55℃1 min，72℃1 min，共15循环;72℃5 min。用内引物进行荧光定量PCR:样本按以下反应体系进行:5定量PCR buffer(美国ABI公司)10 μl，上游引物F(内)(10pM/μl)1 μl，下游引物R(内)(10pM/μl)1 μl，dNTPs(25 mM)(Sigma公司)0.5 μl，荧光探针(10pM/μl)1 μl，Taq酶(美国ABI公司)1.5 μl，定性产物5 μl，ddH2O 30 μl。总体积:50 μl。PCR buffer成分:10 mM Tris-HCl (pH8.0)，50 mM KCl，2 mM MgCl2。反应条件为:93℃3 min，然后93℃45 s，55℃45 s，共40循环。荧光定量仪为PE 7000全自动荧光定量PCR仪(美国Perkin Elmer公司)。反应结束后，由电脑自动分析荧光信号并将其转换为MUC5AC的起始拷贝数及Ct值(Ct值为每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数)。结合RNA的浓度，将荧光定量PCR结果(拷贝/μL cDNA)进行换算，得出待测样本MUC5AC的RNA表达量(拷贝/μg cDNA)。

2 结果

2.1 阳性标准品的荧光定量标准扩增曲线和荧光定量标准曲线MUC5AC阳性标准品的荧光定量标准扩增曲线、荧光定量标准曲线见图1，图2。

图1 阳性标准品MUC5AC荧光定量标准扩增曲线

图2 MUC5AC荧光定量标准曲线

2.2 培养的鼻黏膜上皮细胞MUC5ACmRNA定量表达在培养的鼻黏膜上皮细胞上检测到MUC5ACmRNA的表达，IL-1β刺激组MUC5ACmRNA定量表达为(4.60±1.89)108拷贝/μg，对照组为(2.50±1.40)107拷贝/μg，两组比较差异具有统计学意义(t=4.423，P＜0.05﹚。

3 讨论

研究表明多种因素影响呼吸道上皮细胞黏蛋白MUC5AC的表达:中性白细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase)通过蛋白激酶C、活性氧族、TNF-α转换酶的级联反应诱导气道上皮细胞过量产生MUC5AC［4］;IL-4通过诱导cAMP应答元件结合蛋白(cAMP response element-binding protein，CREB)磷酸化而上调MUC5AC基因表达［5］;神经调节蛋白-1β1(neuregulin 1bet al)通过调节原代培养人支气管上皮细胞中杯状细胞的形成，且以时间和剂量依赖方式上调MUC5AC的表达［6］;脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)诱导MUC5AC表达增加，是通过依赖Rac1的基质金属蛋白酶-9(matrix met alloproteinase 9，MMP-9)分泌和活化后使NCI-H292细胞黏蛋白MUC5AC表达增加［7］;IL-8不仅在两组人呼吸道衍生的细胞株(A549和NCI-H292)以时间和浓度依赖方式上调MUC5AC的表达，而且还上调正常分化的原代人支气管上皮细胞MUC5AC的表达水平［8］。Kim等［9］在培养的人鼻上皮细胞中加入IL-13，结果表明IL-13对MUC5AC的表达和分泌具有抑制作用，而Zhao J等［10］研究却发现IL-13通过促进15脂肪氧化酶1(15-Lipoxygenase-1，15LO1)的活化导致人支气管上皮细胞黏蛋白MUC5AC的表达增加。

IL-1β是在局部和全身炎症反应中起核心作用的细胞因子，能诱导其他炎症细胞因子、趋化因子、粘附分子、急性时相蛋白和组织重建酶等的合成。KIM等［11］研究发现IL-1β以剂量依赖方式上调NCI-H292呼吸道上皮细胞MUC5AC的mRNA和蛋白表达，而Gray等［12］研究表明在高分化的人气管支气管黏膜上皮细胞中，IL-1β以时间和剂量依赖方式增加MUC5AC的蛋白分泌，MUC5AC的mRNA水平表达增高在IL-1β开始刺激1～4 h，4 h后MUC5AC的mRNA表达恢复正常，但MUC5AC的蛋白分泌持续增高至少72 h。Seong等［13］在培养的人鼻上皮细胞中加入炎症介质混合物(TNF-α、IL-1β、IL-4、LPS和PAF)，发现MUC5AC的mRNA表达下调;本研究结果却表明IL-1β刺激鼻黏膜上皮细胞24 h后，MUC5AC的mRNA表达增高﹙P＜0.05﹚，结果与Seong等不一致，可能是由于其对鼻黏膜刺激物为炎症介质混合物，而本研究为单纯的IL-1β。

本研究结果表明IL-1β能上调鼻黏膜上皮细胞黏蛋白MUC5ACmRNA的表达，然而，IL-1β通过何种途径调节粘蛋白MUC5AC基因的表达和蛋白的分泌仍有待进一步研究。

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Effects of MUC5AC gene expression in human nasal epithelial cells lnduced by lnterleukin-1beta

HUANG Xue-kun，LI Yuan，LIU Hong，et al．Department of Otorhinolaryngology，the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-Sun University，Guangzhou，510630，China

ObjectiveTo demonstrate the effects of IL-1β on MUC5AC gene expression in cultured human nasal epithelial cells.MethodsIn passage-2 cultured human nasal epithelial cells，the mRNA levels of MUC5AC gene expression induced by IL-1β were determined by Fluorescent quantitative nested RT-PCR.Results

MUC5AC mRNAs were detected after 24 h of exposure to IL-1β.MUC5AC mRNA levels in IL-1β treatment［(4.60±1.89)108copy/μg］〛were significantly higher than control［(2.50±1.40)107copy/μg］(P＜0.05) .ConclusionIL-1β increased MUC5AC mRNA levels in human nasal epithelial cells.These results suggest that IL-1β may enhance mucin gene expression in cultured human nasal epithelial cells．

Interleukin-1β;Mucin;RT-PCR

510630广州，中山大学附属第三医院耳鼻咽喉头颈外科(黄雪琨李源刘红张革化);中山大学达安基因股份有限公司(徐伟杰)