注射用葛根素的细菌内毒素检查法可行性研究

2010-12-25李薇，吴婷

中国医药导报 2010年5期

李薇，吴婷

（广州市药品检验所药理室，广东广州 510160）

葛根素是从豆科植物野葛干燥根中提取的单体，为异黄酮类化合物，临床及基础研究证明，该药具有扩张冠状动脉和脑血管、降低心肌耗氧量、改善心肌收缩功能、促进血液循环等药理作用[1-2]，临床上现已用于治疗心脑血管及外周血管疾病[3-4]。该品种国家药品标准WS1-（X-388-1）-2003Z进行热原检查[5]，未进行细菌内毒素检查。为考察该品种是否可以用细菌内毒素检查法来代替热原检查法，本文参照《中国药典》2005年版二部附录收载的细菌内毒素检查法对注射用葛根素进行了细菌内毒素检查研究。

1 仪器与试药

注射用葛根素（批号：08020301，规格：0.2 g/瓶，华北制药集团制剂有限公司；批号：20061222，200712131，规格：100 mg/瓶，北京赛生药业有限公司；批号：20060522，200711303，规格：50 mg/瓶，北京赛生药业有限公司；批号：07102801，规格：0.4 g/瓶，山东瑞阳制药有限公司；批号：07121101，规格：0.2 g/瓶，山东瑞阳制药有限公司；批号：07100401，规格：0.1 g/瓶，山东瑞阳制药有限公司；批号：07091602，规格：50 mg/瓶，山东瑞阳制药有限公司）；鲎试剂（批号：0807022，规格：0.1 ml/支，标示灵敏度：0.25 EU/ml，湛江安度斯生物有限公司；批号：080506，081012，规格：0.1 ml/支，标示灵敏度：0.25 EU/ml，厦门市鲎试剂实验厂有限公司鲎试剂）；细菌内毒素工作标准品（批号：150601-200860，规格：160 EU/支，中国药品生物制品检定所）；细菌内毒素检查用水（批号：0801180，规格：50 ml/支，湛江安度斯生物有限公司）；漩涡振荡器（IKA-MS-1）；恒温水浴箱（德国 Julabo 19A）。

2 方法与结果

2.1 鲎试剂标示灵敏度的复核[6-7]

根据鲎试剂灵敏度的标示值，将细菌内毒素工作标准品用BET水溶解，在漩涡振荡器上混匀15 min，然后制成2.00λ、1.00λ、0.50λ 和 0.25λ 4个浓度的内毒素标准溶液，按《中国药典》2005年版二部附录的细菌内毒素检查法规定，对湛江安度斯生物有限公司和厦门市鲎试剂实验厂有限公司两个厂家的鲎试剂进行灵敏度的复核，鲎试剂灵敏度的测定值（λc）=lg-1（∑X/4），式中 X 为反应终点浓度的对数值（lg），结果见表1。3批鲎试剂灵敏度分别为0.25 EU/ml、0.25 EU/ml和0.42 EU/ml，均在 0.5 λ～2.0 λ 范围之间，表明 3 批鲎试剂灵敏度均符合规定，可用于细菌内毒素检查。

表1 鲎试剂灵敏度复核结果Tab.1 The results of tachypleus amebocyte lysate sensitivity test

2.2 注射用葛根素的细菌内毒素限值（L）的确定[6-7]

按《中国药典》2005年版二部中细菌内毒素检查法的规定确定细菌内毒素限值。根据公式L=K/M，式中L为供试品的细菌内毒素限值，K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，注射剂K=5 EU/（kg·h），M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，人均体重按60 kg计算，注射时间若不足1 h，按1 h计算。

从注射用葛根素的产品使用说明书可知本品的最大用药剂量为600 mg，人均体重以60 kg计，滴注时间按1 h计算，则M=600 mg/60 kg·h=10 mg/（kg·h），L=K/M=[5 EU/（kg·h）]/[10 mg/（kg·h）]=0.5 EU/mg。本品为心血管药、儿童老人用药，根据《注射剂安全性检查法应用指导原则（修订稿）》的要求安全系数定为3，本品内毒素最终确定限值为L=0.17 EU/mg。

2.3 注射用葛根素的干扰预试验稀释倍数的确定[8-9]

目前用于药品检验的市售鲎试剂灵敏度（λ）一般在0.50～0.03 EU/mg范围内，最小有效稀释浓度 c=λ/L，L=0.17 EU/mg，故注射用葛根素进行细菌内毒素检测时，0.50～0.03 EU/mg的鲎试剂相对应的最小有效稀释浓度为3.00、1.50、0.75、0.38、0.18 mg/ml。

2.4 干扰预试验试验[8-9]

取 3 批注射用葛根素（批号：08020301，规格：0.2 g/瓶；批号：200711303，规格：50 mg/瓶；批号：07121101，规格：0.2 g/瓶）各1瓶，分别加BET水适量溶解，制成50 mg/ml的供试品原液，用BET水将供试品原液进行倍比稀释，制得3.00、1.50、0.75、0.38、0.18 mg/ml共5个浓度梯度的溶液，将此系列浓度溶液标记为供试品管（NPC系列），用上述稀释液作为溶剂，溶解并稀释细菌内毒素工作标准品，制得每个稀释度中细菌内毒素含量均为2 λ（0.5 EU/ml）的注射用葛根素溶液，标记此系列溶液为供试品阳性对照管（PPC系列）。取灵敏度为0.25 EU/ml的湛江安度斯生物有限公司和厦门市鲎试剂实验厂有限公司两个不同厂家的鲎试剂进行试验，每一稀释度做2管，同时按常规分别设细菌内毒素阳性对照（PC）和检查用水阴性对照（NC）各2管，结果见表2。

表2 注射用葛根素干扰预试验结果Tab.2 The results of prerliminary interference test of Puerarin for Injection

由表2结果可知，所用的3批注射用葛根素稀释到3.0mg/ml浓度的溶液时，有2批样品对湛江安度斯生物有限公司的鲎试剂与细菌内毒素反应有干扰作用，稀释到1.5 mg/ml或以下浓度的溶液时，对两个厂家的鲎试剂与细菌内毒素反应无增强或抑制的干扰作用。

2.5 干扰试验[6-7]

用两个厂家的鲎试剂（灵敏度为0.25 EU/ml），按《中国药典》2005年版二部附录的细菌内毒素检查法进行试验，测定用BET水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（Es）和用供试品稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值（Et）。取3批注射用葛根素（批号：08020301，200711303，07121101）各 1 瓶，分别加 BET 水适量溶解，制成50 mg/ml的供试品原液，再用BET水稀释制成浓度为1.5 mg/ml的供试品稀释液，用BET水和供试品稀释液将细菌内毒素工作标准品稀释成 2.00 λ、1.00 λ、0.50 λ、0.25 λ浓度的BET水系列细菌内毒素溶液和供试品稀释液系列细菌内毒素溶液，每一稀释浓度重复4管，同时用上述供试品稀释液和BET水各做2管阴性对照管，按公式计算BET水和供试品稀释液反应终点浓度的几何平均值（Es和Et），Es=lg-1（∑Xs/4），Et=lg-1（∑Xt/4），结果见表 3。

表3 注射用葛根素的正式干扰试验结果Tab.3 The results of interference test of Puerarin for Injection

由表 3 结果可知，2 λ 管均为阳性，0.50 λ、0.25 λ 管均为阴性，对于λ=0.25 EU/ml的2组鲎试剂的Es分别为0.25 EU/ml、0.35 EU/ml，Es均在 0.5λ～2.0 λ 范围内，3 批注射用葛根素测得的 Et均在 0.5 λ～2.0 λ 范围内，Et和 Es的比值在 0.5～2.0范围内，说明注射用葛根素在1.5 mg/ml或以下浓度的溶液对两个不同厂家的鲎试剂与内毒素的反应无增强或抑制的干扰作用，符合《中国药典》2005年版二部对细菌内毒素检查有效性的规定，因此可以确定注射用葛根素的最大无干扰浓度为 1.5 mg/ml。

2.6 注射用葛根素的细菌内毒素检查

取9批注射用葛根素样品，分别根据“2.5”项下方法制成供试品稀释液，使用λ=0.25 EU/ml的两个厂家的鲎试剂进行细菌内毒素检查，并用此稀释液将细菌内毒素工作标准品稀释为2 λ的溶液，作为供试品的阳性对照，另外以细菌内毒素检查用水建立阳性对照和阴性对照。按《中国药典》2005年版二部细菌内毒素检查法检查，结果见表4。

由表4结果可知，阴性对照管（NC）均为阴性，供试品阳性对照管（PPC）和阳性对照管（PC）均为阳性，实验有效；供试品管（NPC）均为阴性，表明样品中未检出细菌内毒素，9批注射用葛根素的细菌内毒素检查均符合规定。