王晓丹 时晓明 曲显俊 程艳娜 史桂云 高允生

肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是继发于各种原因引起的肝脏炎症或损伤后组织修复过程中的代偿反应,以细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在肝内过量沉积为病理特征[1]。近年的研究[2]表明肝星状细胞(HSC)在肝纤维化的病理生理过程中起着关键作用,HSC从静止转化为激活状态可合成肝脏几乎全部 ECM,因此 HSC的激活是肝纤维化发生的中心环节,同时合成大量 ECM,并通过其合成的基质金属蛋白酶(MMPs)和金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)调节 ECM降解。为了研究 HSC在 ECM降解中的作用及用 HSC研究具有促进 ECM降解的药物,我们尝试了 HSC明胶酶谱的测定方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料 明胶酶(gelatinase,17104-019,美国 Gibco BRL公司产品);TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺),过硫酸胺(amnonium persulfate,AP,A-6761)均为美国 Sigma公司产品;考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue R-250),丙烯酰胺(acrylamide),甲叉双丙烯酰胺(bisacrylamide)均为美国 Bio.Basic.Inc.BBI公司产品 ;Triton X-100、SDS等,美国SERVA公司产品。其余试剂均为分析纯。

1.2 试剂配制 1%明胶：称 1.0 g明胶溶于 100 ml蒸馏水,37℃溶解,4℃保存。样品缓冲液：0.25 mol/L Tris-HCl(pH 6.8),10%SDS,4%蔗糖,0.1%溴酚蓝。电泳缓冲液：0.025 mol/L Tris,0.192 mol/L甘氨酸(pH 8.5),0.1%SDS。洗脱缓冲液：2.5%Triton X-100。明胶酶缓冲液：50 mmol/L Tris,10 mmol/L CaCl2,200 mmol/L NaCl,1μmol/L ZnCl2。染色液：0.25%考马斯亮蓝 R-250(溶于 1︰4.5︰ 4.5的冰乙酸、甲醇和 H2O中)。脱色液：冰乙酸︰甲醇︰ H2O=1︰ 4.5︰ 4.5。

1.3 细胞培养 HSC细胞株购于中国医学科学院肿瘤研究所生物检测中心细胞库,生长于 DMEM培养基(Gibco BRL,Rockville,MD,USA)+15%胎牛血清(含 2 mM L-glutamine,penicillin and streptomycin)中 ,置 37°C(5%CO2～ 95%air)培养箱生长,以0.05%EDTA-PBS分散成为单细胞。取处于对数生长期的细胞用于实验。

1.4 明胶酶的酶谱法测定

1.4.1 制胶 与普通的聚丙烯酰胺凝胶的制胶过程相同,只在分离胶中加入 1%的明胶,使明胶的终浓度为 0.1%。

1.4.2 样品制备 HSC培养 24 h后的细胞培养基离心后以 2︰ 1与样品缓冲液混匀,取 15μl上样电泳。

1.4.3 电泳 于 BIO-RAD电泳槽中,常温 80 V电压电泳 30 min,100 V电压电泳 1.5 h。

1.4.4 洗脱 将胶置于洗脱缓冲液中,脱色摇床上洗脱 15 min,蒸馏水中漂洗 3次,充分除去 SDS。

1.4.5 反应 将胶置于反应缓冲液中 37℃反应过夜。

1.4.6 染色及脱色 将胶自反应液中取出,三蒸水漂洗 2次,染色液中常温染色 4 h,蒸馏水漂洗 2次,置脱色液中常温脱色 15 min,照相、记录。

2 结 果

2.1 培养的 HSC 图 1显示培养 10d的 HSC,细胞呈星形、多边形、棱形,有很长的细胞突起。细胞复苏以后传代培养,此时的 HSC是研究 ECM合成与降解的良好材料。

图1 培养 10d的 HSC(×400)

2.2 酶谱法检测到的 MMPs活性条带 此方法能够灵敏地检测到 HSC分泌到细胞外的 MM--2和MMP-9,并且 MMP-2的活性高于 MMP-9(图 2)。当A3处理 24h以后,培养基中的 MMPs活性发生了改变,培养基中检测到 MMP-9和 MMP-2并且 MMP-2活性增加(图 3)。

图2 酶谱法检测到MMPs

图3 A3处理 24h后 MMPs活性

3 讨 论

肝纤维化是肝脏 ECM合成与分解代谢失衡所造成的不良结局,是临床上常见的病理生理改变。HSC在肝纤维化的病理生理过程中起着关键作用,既参与 ECM合成,也调节其降解,是造成 ECM在细胞外过度堆积的重要原因。酶谱法为研究 HSC MMPs基因表达差异,内源及外源性激活条件,酶活性的调节,从而研究肝纤维化的病理生理机制和研究具有促进肝纤维化过程中 ECM降解的药物和方法有重要意义。用含明胶的聚丙烯酰胺凝胶电泳为基础的酶谱法,能够检测到 HSC细胞内和培养基中的 MMP-2和 MMP-9,并且培养基中 MMP-2活性高于MMP-9,这与文献报道的 HSC较高的表达 MMP-2 mRNA相一致[3]。当药物作用后,培养基中 MMP-2显著增加,表明 MMPs的表达发生了改变,或者酶被激活。目前,常用于检测 MMPs的方法主要是ELISA和放免法,这些方法只能检测其含量,不能检测其活性。而 MMPs活性受到 TIMPs调节,TIMPs通过与 MMPs非共价结合,从而抑制 MMPs的活性和 ECM降解,MMPs的数量不反应其对 ECM的降解能力,因此,测定 MMPs活性更有意义[4]。酶谱法不影响 TIMPs与 MMPs的结合,能够测定 MMPs的活性,反映其在 ECM降解过程中的作用,并且此方法经济、简便、重复性好。

[1] 高润平,齐晓艳.肝纤维化的发生机制与治疗进展[J].世界华人消化杂志,2006,14(23)：2263-2269.

[2] 赵稳兴,.梁崇礼.酶谱法测定肝星状细胞合成的基质金属蛋白酶活性[J].中国应用生理学杂志,2002,18(2)：56-58.

[3] Lichtinghagen R,Breitenstein K,Arndt B,et al.Comparison of matrix metalloproteinase expression in normal and cirrhotic human liver[J].Virchows Arch,1998,432：153-158.

[4] Herron GS,Banda MJ,Clart E J,et al.Secretions of metelloproteinase by stimulated capillary endothelial cells[J].JBiol Chem,1986,261：2814-2818.