匡勇娇，石玉平，任世霞，周小玲，王永宁，*，梅后敏

（1.青海师范大学化学系，青海西宁810008；2.青海师范大学生命与地理科学学院，青海西宁810008）

青藏高原油菜蜂花粉中脂肪酸的提取及GC分析

匡勇娇1，石玉平1，任世霞1，周小玲1，王永宁1，*，梅后敏2

（1.青海师范大学化学系，青海西宁810008；2.青海师范大学生命与地理科学学院，青海西宁810008）

以石油醚为溶剂，通过正交试验确定青藏高原油菜蜂花粉中的脂肪油最佳提取条件为：浸提时间为12 h，花粉重量与溶剂体积的比值为1∶10（g/mL），花粉粒度为大于40目。提取的脂肪油含量进行对比，结果表明：破壁花粉中脂肪油的含量高于未破壁花粉。提取的花粉油进行甲酯化处理，利用气相色谱法分析，油菜蜂花粉脂肪油的主要成分为：亚麻酸、油酸、棕榈酸、亚油酸、芥酸等，破壁花粉油中不饱和脂肪酸的含量要比未破壁花粉油中的不饱和脂肪酸的含量高。

油菜蜂花粉；脂肪酸；石油醚；提取；GC

Abstract:The optimum extraction conditions of fatty acids in rape bee pollen of the Qinghai-Tibet Plateau was determined by orthogonal experiments with petroleum ether solvent：extraction time was 12 h,the ratio of the pollen weight and solvent volume was 1∶10（g/mL）,the grain size of pollen was greater than 40 mesh.Comparing the content of fatty oil extracted,the result showed that the content of the wall-broken pollen fatty oil is higher than that of the wall-unbroken pollen fatty oil.The pollen oils extracted were methylated,analyzed by GC-MS,are the chief components of Rape bee pollen fatty oils were linolenic acid,oleic acid,Hexadecanoic acid,linoleic acid,erucic acid,etc.,the unsaturated fatty acids content of the wall-broken pollen oil is higher than that of the wall-unbroken pollen oil.

Key words：rape bee pollen;fatty acid;petroleum ether;extraction;GC

花粉是一种营养最全面的食疗佳品，具有强体力增精神，迅速消除疲劳和美容、抗衰老等作用。花粉研究是一门生命科学，对花粉营养和抗衰老作用活性物质的探索将窥测大自然的奥秘。我国花粉资源丰富，应及时开发，充分利用，我们在花粉学方面应迎头赶上。

蜂花粉是蜜蜂从植物花朵上采集花粉的过程中加入一些花蜜和唾液，以使花粉黏集成团，即形成花粉团。蜂花粉是自然界赋予人类的优质营养源，含有的200余种营养成分，是人体必需氨基酸、不饱和脂肪酸、维生素、多酚类和黄酮类物质、多糖等活性物质[1]，所以被称为是最完美的营养保健食品之一[2]。花粉中的不饱和脂肪酸主要为亚麻酸和亚油酸[3]。不饱和脂肪酸尤其是多不饱和脂肪酸不仅在维护生物膜的结构和功能方面起重要作用,而且在治疗心血管疾病、促进细胞的生长、抗癌以及免疫调节等方面功效显著，而亚油酸及亚麻酸被公认为人体必需的脂肪酸（EA），在人体内可进一步衍化成具有不同功能作用的高度不饱和脂肪酸，如AA、EPA、DHA等[4]。其中最重要的是EPA（二十碳五烯酸）和DHA（二十二碳六烯酸），EPA是体内三烯前列腺素前体，DHA是大脑、视网膜等神经系统磷脂的主要成分[5]。

青藏高原地区油菜蜂花粉资源量十分丰富，具有无化学和生物污染的特点，但因受高原寒冷、干旱和缺氧等恶劣气候的影响，其花粉孢子壁通常异常坚硬，以适应不良的气候条件。破壁是准确测定花粉中活性物质的基本保证，从而使花粉中的营养物质容易释放，达到提取完全的目的。采用生物酶解法对青藏高原产油菜蜂花粉进行破壁[6]，利用石油醚提取，采用气相色谱法(GC)对青海产油菜蜂花粉及破壁花粉的脂肪酸成分进行较全面的测定，比较它们之间的变化，意为青藏高原油菜蜂花粉的开发、利用提供参考。

1 材料、试剂、仪器

1.1 材料

油菜蜂花粉分别购自青海湟中县、祁连县和青海湖地区,50℃真空干燥至恒重后备用。

1.2 主要试剂

棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸（气相色谱标准）；石油醚、正己烷、甲醇、氢氧化钠（试剂均为分析纯）；复合酶、水为蒸馏水。

1.3 主要仪器

RE-52A型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；7890A气相色谱仪，Sepu3000色谱工作站。

2 方法

2.1 花粉的预处理

采用生物酶法将花粉进行破壁，这种方法在一定温度和pH值的条件下，通过控制花粉量与生物酶的量之比、花粉量与水量之比，花粉破壁率达到90%以上。破壁花粉在自然条件下晾干后，置于真空干燥箱中在一定温度下烘干。将烘干的破壁和未破壁的花粉分别碾碎过筛（8目～20目为粗颗粒；20目～40目为中颗粒；大于40目为细颗粒），分成3种（粗、中、细）不同的粒度。

2.2 花粉脂肪油的提取

花粉油常用的提取方法有索氏提取法、超声法提取、冷浸法提取[7]、超临界CO2萃取技术[8]。在花粉脂肪油的提取过程中,为了避免高温对有效成分的破坏，采用冷浸法在常温常压下以石油醚为提取溶剂，在室温条件下进行花粉油的提取。精密称取样品10 g于碘量瓶中,以石油醚为溶剂在室温下浸提一定的时间后，用旋转蒸发仪回收溶剂，再在真空干燥箱中干燥至恒重得到花粉脂肪油。

2.3 采用正交试验设计以确定最佳浸提条件

2.3.1 试验因素水平表设计

试验选择溶剂用量、浸提时间、花粉粒度3个因素为考察对象，每个因素确定3个水平，采用L（933）正交表安排试验，见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2.3.2 破壁花粉正交试验

精密称取样品10 g，以石油醚为溶剂，按正交表进行试验，称重并计算产率，结果见表2。

表2 正交试验结果Table 2 Results of L9(33)orthogonal test

从表2中数据可以看出，最佳提取条件为A3B3C3，即提取时间为36 h，溶剂用量为150 mL，花粉粒度＞40目时是最佳提取条件。

2.3.3 未破壁花粉正交试验

方法同2.3.2，正交试验结果见表3。

从表3中数据可以看出，最佳提取条件为A3B3C3,即提取时间为36 h,溶剂用量为150 mL,花粉粒度＞40目时是最佳提取条件。

表3 正交试验结果Table 3 Results of L9(33)orthogonal test

2.4 甲酯化[9]

脂肪酸甲酯化条件：取脂肪油0.5 mL，分别加入2.0 mL正己烷和1.0 mL氢氧化钠甲醇溶液（0.5 mol/L），置水浴上70℃回流10 min，取出冷却后，移置刻度试管中，加水至10 mL，振荡、超声提取、离心。取上层清液进行GC分析。

2.5 GC分析条件

分析条件：纯度99.99%的氮气为载气；FFAP柱（30 m×0.32 mm×0.33 μm）；柱初温 100℃，以 10℃/min升温速率升至280℃，保温15 min；进样口温度280℃；检测器温度（FID）280 ℃；进样量 1 μL，分流比为 50∶1。

将粗脂肪甲酯化处理后上机分析,得到油菜蜂花粉油的色谱图（见图1，图2）。

以保留时间和标准谱图对照、分析确认各种脂肪酸。化合物定量按峰面积归一化计算出各峰面积的相对百分含量结果分别见表4。

表4 油菜蜂花粉脂肪酸组成及含量Table 4 Identified chemical components of fatty acids extracted from rape bee pollen

3 结果与讨论

3.1 破壁花粉油中的不饱和脂肪酸的含量高

从表4可以看出，在鉴定出的脂肪酸成分中，破壁和未破壁花粉中亚麻酸含量分别占总脂肪酸的30.59%和25.44%，两者的不饱和脂肪酸的总含量都较高，而且破壁花粉油中的不饱和脂肪酸的含量要比未破壁花粉油中的不饱和脂肪酸的含量高。这可能是通过破壁使细胞内的脂肪酸容易释放出来的缘故。

3.2 提取时间对脂肪酸提取的影响

由表2和表3数据可以看出，虽然提取率随着时间的增加，提取率逐步提高，但增加幅度并不大，考虑到生产周期，因此提取时间确定为12 h为宜。

3.3 提取次数对提取率的影响

在最佳提取条件下第1次浸提所得粗脂肪占油菜破壁蜂花粉干重的约8.7%，未破壁的粗脂肪占油菜未破壁花粉干重的约7.8%。将第1次浸提的滤渣在相同条件下再浸提2次，第2次油的得率约为花粉干重的0.3%左右，第3次油的得率约为0.1%。考虑到提取剂的损耗及提取成本，提取3次为最佳提取次数。

3.4 花粉粒度对提取率的影响

花粉粒度为细时提取率最高，颗粒度为粗时油的提取率最低。当碾碎的破壁和未破壁花粉的粒度大于100目时，提取率反而下降，这可能是细的颗粒度在浸取时会发生沉淀，导致花粉与提取液接触的比表面降低所致。因此提取剂与花粉充分接触是提高提取率的先决条件。

3.5 最佳提取条件分析

对破壁和未破壁花粉考虑到实际生产条件及降低溶剂的用量，其最佳提取条件为12 h，花粉与提取剂的固液比（g/mL）为1∶10，花粉的颗粒度大于40目为最佳提取条件。

4 结论

采用冷浸法提取花粉中的脂肪油，设备简单，操作方便，适宜于工厂生产。而且青藏高原地区油菜蜂花粉资源量十分丰富，具有很好的开发价值。

[1]刘建涛，赵利,苏伟,等.蜂花粉生物活性物质的研究进展[J].食品科学，2006,27(12)：909-911

[2]许具晔.蜂花粉对人体的保健作用[J].农产品加工,2004(10)：24-25

[3]王开发.花粉营养成分与花粉资源利用[M].上海：复旦大学出版社,1993：37

[4]鲍建民.多不饱和脂肪酸的生理功能及安全性[J].中国食物与营养,2006(1)：45-46

[5]范文洵.α-亚麻酸及其代谢产物EPA和DHA[J].生理科学进展,1998,19(2)：110-113

[6]王永宁,石玉平,卢挺.油菜蜂花粉酶法破壁研究[J].天然产物研究与开发,2004,16(3)：228-230

[7]梁惠花,刘晓河,王志宝.坝上油菜蜂花粉中脂肪油的提取及稳定性研究[J].中成药,2004,26(9)：768-769

[8]雷华平,史庆龙,葛发欢,等.蜂花粉脂肪油超临界CO2萃取及GC-MS 分析[J].中药材,2004,27(3)：177-180

[9]回瑞华,侯冬岩,李铁纯,等.不同产地稻米油脂中脂肪酸的气相色谱-质谱分析[J].质谱学报,2008,29(6)：349-352

Extraction and GC Analysis of Fatty Acids in Rape Bee Pollen of the Qinghai-Tibet Plateau

KUANG Yong-jiao1,SHI Yu-ping1,REN Shi-xia1,ZHOU Xiao-ling1,WANG Yong-ning1，*,MEI Hou-min2
（1.Chemistry Department，Qinghai Normal University，Xining 810008，Qinghai,China；2.College of Life and Geographic Sciences，Qinghai Normal University，Xining 810008，Qinghai,China）

2009-12-02

青海省重点科技攻关资助项目（2002-N-119）

匡勇娇（1984—），女（汉），硕士研究生，研究方向：生物无机化学。

*通信作者：王永宁（1951—），男，教研室主任，教授，硕士生导师，主要从事天然产物的研究与开发。