林 淼 赵志辉 雷 萍

近年来，随着我国饲料工业的迅猛发展，鱼粉的需要量逐年增加，鱼粉的质量问题越来越引起饲料行业、养殖业的重视。鱼粉是水产饲料的主要蛋白源，尤其含有动物生长所必需的氨基酸，含量丰富且配比合理，在饲料、养殖行业中起着不可代替的作用。由于用量大，价格高，有些商家在鱼粉中掺杂使假、以次充好，使鱼粉质量参差不齐，给市场造成了一定的混乱[1-2]。掺假、掺杂鱼粉中往往是掺入两种或两种以上杂质，并且有些鱼粉因加工工艺不当造成腐败，这给鱼粉品质分析带来了一定的困难。因此，有必要建立一个有效的手段对鱼粉中的氨基酸进行定量分析。目前，只有少数几篇文献涉及到鱼粉的定量分析。对于氨基酸的分析大多采用液相色谱[3]、气相色谱-质谱联用[4-5]、毛细管电泳[6]、凯氏定氮法[7]和光谱法[8-9]等。然而，这些方法或试剂费用昂贵，或分离效率低，有些方法还不能同时测定多种氨基酸。运用氨基酸分析仪可解决上述问题，同时方法操作简便，重现性好，灵敏度高。

1 实验部分

1.1 方法原理

氧化水解法是将鱼粉中的氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸等)用过甲酸氧化，然后进行酸解，再经离子交换色谱分离、测定[10]。脯氨酸在570 nm处有最大吸收峰，除脯氨酸外，其他各氨基酸均在440 nm有最大吸收峰。因此，在570 nm检测波长计算脯氨酸含量，而在440 nm检测波长计算其它各氨基酸含量。

1.2 试剂与材料

1.2.1 试剂

过甲酸溶液：将30%过氧化氢与88%甲酸按1：9(体积比)混合，于室温下放置1 h，置冰水浴中冷却30 min(临用前配制)；48%氢溴酸；6.0 mol/l盐酸溶液：将优级纯盐酸与水按1：1(体积比)混合；茚三酮溶液；流动相：参照表1。

表1 流动相梯度洗脱

除特殊说明，所用试剂均为分析纯。实验用水为超纯水。

1.2.2 氨基酸混合标准储备液

含天门冬氨酸、苏氨酸等17种常规蛋白水解液分析用层析纯氨基酸，各组分浓度C(氨基酸)=100 nmol/ml。

1.3 仪器与设备

Aminosys A200自动氨基酸分析仪系统：配有微型光度检测器、超声波提取器、溶剂微孔过滤器带0.22 μm水相滤膜、涡旋振荡器、水浴锅、真空泵。

1.4 实验方法

1.4.1 试样制备

称取鱼粉0.5 g左右(精确至0.000 1 g)，置于20 ml浓缩瓶或浓缩管中，于冰水浴中冷却30 min后加入已经冷却的过甲酸溶液2 ml，加液时需将样品全部润湿，但不要摇动，盖好瓶塞，放入55℃水浴反应15 min，直至全部样品氧化成浅土黄色；向浓缩管中加入氢溴酸0.3 ml，振摇，使反应终止；抽真空；加入约15 ml盐酸溶液，摇匀，超声使其溶解，再抽真空，封口，置恒温箱中，（110±1）℃下水解 22～24 h；取出浓缩管，冷却，用水将内容物定量地转移至50 ml容量瓶中，定容；过0.22 μm滤膜后即可上机。

1.4.2 色谱分析

色谱条件：氨基酸柱(安米诺西斯公司生产)；柱温：采用程序升温，58 ℃(0～38 min)、70 ℃(38～43 min)、75℃(43～75 min)和58℃(75～82 min)；流动相流速：0.2 ml/min；检测波长：440 nm/570 nm双波长同时检测；反应器温度：115℃；分别取标准溶液及试样20 μl进样。根据保留时间及标准加入法定性，试样峰面积与标准峰面积比较定量。

2 结果与讨论

2.1 氨基酸的色谱分析

实验所测定17种氨基酸标样色谱图见图1。0～64 min图谱显示440 nm检测结果，64 min后显示570 nm检测结果。从图1可看出，17种氨基酸在选定的分离条件下可以达到很好的分离效果。

2.2 精密度和准确度实验

在上述优化条件下，将浓度均为100 nmol/ml的氨基酸混合标准溶液连续进样9次，峰面积的相对标准偏差(RSD)按出峰次序分别为3.3%(胱氨酸)、4.2%(蛋氨酸)、2.3%(天门冬氨酸)、4.1%(苏氨酸)、3.7%(丝氨酸)、2.8%(谷氨酸)、2.4%(脯氨酸)、2.4%(甘氨酸)、4.1%(丙氨酸)、3.4%(缬氨酸)、1.9%(异亮氨酸)、2.8%(亮氨酸)、4.3%(酪氨酸)、1.9%(苯丙氨酸)、3.2%(组氨酸)、2.7%(赖氨酸)、2.3%(精氨酸)，实验结果表明，在上述优化条件下本实验方法是可行的。

图1 氨基酸标准谱图

2.3 方法线性方程、检出限及回收率实验

对氨基酸的混合标样进行测定，得出该方法的检出限、线性范围，所得的数据见表2。由表2可知，该方法对17种氨基酸的检测具有较低的检出限、较宽的线性范围和较高的回收率，较高的回收率也说明了用该方法检测鱼粉中的氨基酸所得到的数据是准确可靠的。

表2 17种氨基酸的线性回归方程、相关系数、检出限及回收率

图2 国产鱼粉中氨基酸标准谱图

3 鱼粉中氨基酸的测定

用所建立的方法检测了4家国内不同厂家鱼粉及2家进口鱼粉，国内鱼粉和进口鱼粉各选择一个有代表性的典型样品图谱见图2、图3，6家样品的分析结果见表3(其中样品1～4为4家国内不同厂家鱼粉，样品5～6为进口鱼粉)。

4 结论

当前饲料企业步履维艰，如果不控制好原料的质量，特别是昂贵的动物性蛋白饲料——鱼粉，后果将是严重的。鱼粉是饲料工业的重要原料，其水解液中氨基酸的测定对其营养评价和饲料配制具有重要意义，所以使用鱼粉的饲料企业只有严把质量关，才能控制成品的质量，并使养殖户用上优质的饲料。文中使用氨基酸分析仪测定鱼粉中的氨基酸的方法，快速、简便和灵敏，所得图谱为鱼粉的质量控制提供了直观、可靠的科学佐证。

图3 进口鱼粉中氨基酸标准谱图

表3 鱼粉中氨基酸的分析结果(n=3)（%）

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