付小猛 赵述淼 梁运祥 葛向阳

因抗生素的滥用而导致的毒性残留、耐药性等问题已引起人们的广泛关注。寻找安全、无毒的替代品迫在眉睫。作为抗生素的替代品之一，芽孢杆菌制剂能抑制肠道腐败菌的生长，促进动物生产，并且能形成芽孢，可以耐受高温和具有良好的贮存性能，一直都是畜牧业科研和生产人员关注的焦点[1]。

芽孢的形成受环境因素的影响，不同菌种形成芽孢的条件不同。枯草芽孢杆菌的芽孢较其它营养体细胞易保存，存活率高，是制备枯草芽孢杆菌制剂的理想存在形式，而制剂中的芽孢含量是影响产品应用效果的关键因素[2]。目前,芽孢杆菌制剂的生产方式有两种：液态发酵和固态发酵。液态发酵易实现纯培养和工业化生产，但对设备要求高，生产工艺复杂，且环境污染严重；而固体发酵采用的原料一般是廉价的农副产品(如麸皮、谷壳等)，采用的设备也较液体发酵简单，生产成本大大低于液体发酵。因此，选取合适的生产方式，实现低成本、高产率，满足畜牧业生产发展的需要，是一个亟待解决的课题[3]。本课题的研究目的就是通过对枯草芽孢杆菌固态发酵工艺的优化，以期获得较佳产孢条件，为饲用枯草芽孢杆菌制剂的产业化生产提供基础。

1 材料与方法

1.1 菌种

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CCAM 080032，本实验室保藏。

1.2 培养基

液体种子培养基：LB液体培养基；平板计数培养基：LB固体培养基；固体发酵培养基原料及试剂：麸皮、稻草粉、葡萄糖、胰蛋白胨、NH4NO3、KH2PO4等。

1.3 种子液的制备

从活化好的枯草芽孢杆菌试管斜面接一环菌种至液体种子培养基，置37℃、200 r/min控温摇床下培养17 h。

1.4 固态培养

根据试验配方称取固体发酵培养基原料，装料量为40 g，加入适当蒸馏水，121℃高压灭菌30 min，冷却至室温后，以接种量为5%接入种子液，在37℃培养48 h，然后60℃烘干、粉碎、计芽孢数。

1.5 芽孢计数方法

按平板菌落计数法[4]计算芽孢数：准确称取粉碎后发酵物料10 g，放入盛有90 ml无菌生理盐水的三角瓶中制成菌悬液，80℃水浴15 min杀死营养体，然后将菌悬液稀释至10-7～10-8，取100 μl均匀涂布到LB平板上，于37℃倒置培养24 h，进行菌落计数。

1.6 培养基优化

1.6.1 培养基固体基质的选择

用膨润土、玉米芯粉、稻草粉、谷壳、豆粕分别与麸皮以 1： 3（w/w）混合，料水比为 1： 1.5，按初始条件进行发酵，发酵结束测定芽孢产量，确定最适的基质成分。确定基本组成后，再按比例配制基质，确定两种基质的最佳配比。

1.6.2 外加碳源优化

分别按50 g/kg的浓度添加葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉到培养基中。其他条件保持一致，37℃发酵48 h后测定芽孢产量。确定最适外加碳源的种类。

1.6.3 外加氮源优化

按表1所示比例分别添加硝酸钠、硝酸铵、氯化铵、硫酸铵、尿素、胰蛋白胨、酵母抽提物到含50 g/kg葡萄糖的基础培养基中。其他条件保持一致，37℃发酵48 h后测定芽孢产量，确定最适外加氮源的种类。

表1 外加氮源对芽孢产量的影响

1.6.4 培养基的正交设计试验

依据之前的试验结果，且根据磷酸盐是细菌细胞壁合成必需的营养元素，在固体发酵中可以促进菌体生物量的增加[5]，选择葡萄糖、胰蛋白胨、硝酸铵以及磷酸二氢钾四个因素，采用正交设计表L9（34），以确定最佳培养基配方。

1.7 培养条件优化

1.7.1 发酵时间的确定

将枯草芽孢杆菌CCAM 080032在37℃下进行固态培养，每12 h取样测定芽孢产量，以确定最适的发酵时间。

1.7.2 发酵温度的选择

分别在 30、34、37、40、45 ℃的温度下，发酵 48 h后测定芽孢产量，确定最适的发酵温度。

1.7.3 料水比的确定

通过控制添加的蒸馏水的量，使培养基料水比分别为 1： 1、1： 1.25、1： 1.5、1： 1.75，其他条件保持一致，37℃发酵48 h后测定芽孢产量，以确定最佳的初始料水比。

2 结果与分析

2.1 培养基优化

2.1.1 培养基固体基质的选择

在固体发酵中，基质的选择非常关键。基质不仅能为菌体的生长提供必需的底物，还可以影响微生物发酵过程的传质、传热及微生物的代谢功能等。不同的基质，由于其疏松程度不一样，氧和热量的传递效率也不一样。固态发酵培养基的发酵基质一般为透气性较好、营养丰富的麸皮。在发酵过程中，为了增加培养基的透气性，可以添加适量的其他基质。在供试的5种固体基质中，稻草粉可以显著提高芽孢产量，芽孢产量达到5.67×1010CFU/g干物料（见图1）。

图1 不同固体基质对芽孢产量的影响

确定麸皮和稻草粉为固体发酵的基质后，进一步优化其配比。结果表明（见图2），稻草粉的含量过高或过低都不利于芽孢产量的提高，稻草粉和麸皮的最适比例应控制在2：8。此时，芽孢产量达到5.90×1010CFU/g干物料。

2.1.2 外加碳源优化

分别按50 g/kg的浓度添加葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉到培养基中。其他条件保持一致进行发酵，结果如图3所示，以葡萄糖为外加碳源时枯草芽孢杆菌的芽孢产量明显高于蔗糖、麦芽糖和可溶性淀粉，最高可达到6.23×1010CFU/g干物料。说明该枯草芽孢杆菌生长的最适碳源为葡萄糖。

图2 麸皮与稻草最佳比例的确定

图3 外加碳源对芽孢产量的影响

2.1.3 外加氮源优化

按表1所示比例分别添加 NaNO3、NH4NO3、NH4Cl、(NH4)2SO4、(NH2)2CO、胰蛋白胨、酵母抽提物到含50 g/kg葡萄糖的基础培养基中。其他条件保持一致进行发酵，结果如表1所示，以NH4NO3和胰蛋白胨为外加氮源时该枯草芽孢杆菌的芽孢产量有所提高，分别达到 6.53×1010CFU/g 和 6.93×1010CFU/g，这说明此菌既能利用有机氮源也能利用无机氮源，因此，以NH4NO3和胰蛋白胨组成的复合氮源为其最适的外加氮源。

2.1.4 培养基的正交设计试验

依据之前的试验结果，选择葡萄糖、胰蛋白胨、NH4NO3以及KH2PO4四个因素，采用正交设计表L9（34），以确定最佳培养基配方。从极差分析结果可以看出，影响芽孢产量的主要因素排序为：胰蛋白胨＞NH4NO3＞葡萄糖＞KH2PO4。从正交试验得到外加营养物质最适的组分含量为葡萄糖50 g/kg、胰蛋白胨20 g/kg、NH4NO315 g/kg、KH2PO410 g/kg。采用最优的一组培养基进行发酵，芽孢产量可达到7.26×1010CFU/g。

表2 正交试验L9（34）测试结果

2.2 培养条件的优化

2.2.1 发酵时间的确定

发酵周期也是一个很重要的试验指标，因为缩短发酵周期就意味着降低能耗，节约生产成本，增加生产批次[6]，将枯草芽孢杆菌在37℃下进行固态培养，每12 h取样测定芽孢产量。结果如图4所示，菌株在培养12～48 h内，芽孢产量呈明显上升趋势，48 h时达最大值，然后随着培养时间的延长(48～60 h)，芽孢产量不再增加甚至下降，而且，在生产实践中随着培养时间的延长对能源的消耗和污染杂菌的机会都会增加，因此，最适的发酵时间为48 h，此时芽孢产量最高，为 6.67×1010CFU/g干物料。

图4 发酵时间对芽孢产量的影响

2.2.2 发酵温度的选择

在 30、34、37、40、45 ℃的发酵温度下，发酵 48 h后测定芽孢产量，结果如图5所示，温度过高时培养基水分迅速丧失，而温度过低导致菌体生长缓慢，在37℃时芽孢产量达到最大，为6.95×1010CFU/g。因此，该菌株最适生长温度为37℃。

图5 温度对芽孢产量的影响

2.2.3 料水比的确定

固态发酵最大的特点就是无游离水，因而底物含水量的变化，对微生物的生长及代谢能力会产生重要的影响[7]。适宜的初始含水量，有助于菌体吸收培养基的营养物质和氧的传递，从而促进菌体的生长繁殖。结果如图6所示，水分过高或过低都会导致芽孢产量的下降，而最适的料水比为1：1.5，此时芽孢产量达到 7.9×1010CFU/g。

图6 料水比对芽孢产量的影响

3 讨论

研究结果表明，固体培养基的成分和发酵条件（如发酵时间、温度及料水比等）都是影响芽孢形成和生物量的重要因素。通过单因素试验及正交试验方法，确定了枯草芽孢杆菌CCAM 080032的最优培养基为：稻草粉：麸皮2：8、葡萄糖50 g、胰蛋白胨20g、NH4NO315g、KH2PO410g、H2O1500g，在 37 ℃培养 48 h后，芽孢产量可达到7.90×1010CFU/g。

近年来，枯草芽孢杆菌作为饲料微生态制剂在畜禽养殖中受到越来越广泛的应用，而通过优化培养基和培养条件提高其芽孢产量是降低生产成本的重要手段。张志焱等[8]通过优化固态发酵工艺，最终使枯草芽孢杆菌的活菌数达到460亿个/g；而Chen等[9]、郭小华等[10]通过液态深层发酵获得的芽孢产量分别为1.52×1010CFU/ml和3.10×109CFU/ml。与前人的研究结果相比，本研究所采用的固态发酵工艺的生产成本更低、产量更高，具有较大的优势。

与固态发酵相比，液态发酵从实验室规模到工业规模的发酵放大以及限制因素的检测和控制相对容易，而固态发酵在传质、传热方面还缺乏全面的、详细的研究[11]。因此，固态发酵的实验室小试和工业化生产之间的条件控制有很大的差异，如何改进生产中的发酵设备及发酵条件，使之实现工业化生产是下一步迫切需要解决的问题。

[1]Hong H A,Le H D,Cutting S M.The use of bacterial spore formers as probiotics[J].FEMS Microbiol.Rev.,2005,29:813-835.

[2]宋卡魏,王星云,张荣意.培养条件对枯草芽孢杆菌B68芽孢产量的影响[J].中国生物防治,2007,23(3):255-259.

[3]谷春涛,萨仁娜,佟建明.地衣芽孢杆菌TS-01固态发酵培养基的优化[J].微生物学通报,2004,31(4):53-56.

[4]赵述淼.猪源益生芽孢杆菌的分离筛选与应用研究 [D].华中农业大学,2009.

[5]陈洪章，徐建.现代固态发酵原理与应用[M].北京：化学工业出版社，2004：37-39.

[6]崔京春,吴俊罡,刘吉华,等.枯草芽孢杆菌发酵过程的优化[J].饲料工业,2004,7:52-55.

[7]张锦亮.固体发酵技术应用的研究进展[J].重庆科技学院学报(自然科学版),2005,7:64-66.

[8]张志焱,徐海燕,杨军方.枯草芽孢杆菌固体发酵培养基的优化[J].饲料博览,2005,09:34-36.

[9]Chen Z M,Li Q,Liu H M,et al.Greater enhancement of Bacillus subtilis spore yields in submerged cultures by optimization of medium composition through statistical experimental designs[J].Appl.Microbiol.Biotechnol.,2010,85:1353-1360.

[10]郭小华,陆文清,邓萍,等.益生枯草芽孢杆菌MA139增殖培养基的优化[J].中国农业大学学报,2006,11(3):41-46.

[11]孙森,宋俊梅,张长山.固态发酵技术的研究应用现状[J].中国食品添加剂,2007(4):54-58.