王玉芳 孟凡杰 冯向飞

(潍坊市益都中心医院 山东潍坊 262500)

动脉粥样硬化是慢性炎症和免疫反应的交互过程[1],HSP和细胞凋亡参与该过程。其中,易损斑块的破裂是急性冠脉综合征(ACS)的病理基础。通过建立兔动脉粥样硬化易损斑块模型,研究HSP70和细胞凋亡在兔动脉易损斑块中的作用,寻找稳定斑块的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

(1)健康纯种大白兔32只,1.5～3.0kg,月龄(3.7±1.5)个月,雌雄不限。

(2)试剂与药品:①兔单克隆抗HSP70抗体:Santa Cruz公司产品。②细胞凋亡试剂盒MK1020:购自武汉博士德公司。③SP免疫组化检测试剂盒为北京中山公司产品。

1.2 方法

(1)兔动物动脉粥样硬化斑块模型的制作由二医大实验动物中心提供并协助制作动脉粥样硬化斑块模型,制备石蜡标本。

(2)病理学检查:①大体形态:观察动脉斑块形成情况;②组织病理:取最大动脉斑块,经固定、包埋后横切制成3～5μm切片,HE染色,光学显微镜观察。

(3)易损斑块认定与与分区切片经HE染色,在显微镜下观察,分为4个区:纤维帽区(斑块表面)、)脂核区(斑块中部),肩部区(斑块与正常血管壁交界处)和中膜平滑肌区(基底部区)。同时根据细胞及核的形状、大小及染色情况来区分不同的细胞,如平滑肌细胞和炎症细胞。

(4)HSP检测采用免疫组化技术,SP(链霉菌抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物)法。

(5)细胞凋亡检测采用TUNEL法。即采用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记法。

(6)计算方法:显微镜(×400)下观察,用IPP(Image Pro Plus)图像分析软件分别计算各区中HSP70表达阳性细胞和TUNEL阳性细胞数,分别计算其百分数,取均值代表每一样本数。)

表1 兔易损斑块中HSP70高表达细胞和TUNEL阳性细胞分布情况[(n=28),(±s)]

表1 兔易损斑块中HSP70高表达细胞和TUNEL阳性细胞分布情况[(n=28),(±s)]

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图1 肩部区HSP70的阳性表达情况(×100)

图2 平滑肌区细胞凋亡的情况(×200)

2 结果

(1)HSP70在兔动脉易损斑块中的表达。HSP70在正常细胞胞浆表达呈均匀淡紫色,阳性表达细胞呈深浅不一的棕褐色(图1)。纤维帽区平滑肌细胞表现为HSP70高表达,与其余三区差异均有显着性(P<0.01,P<0.01,P<0.05)。纤维帽区和肩部区炎症细胞表现为HSP70高表达,与其余二区均有显着性差异(P<0.01,P<0.01)(表1,图1)。

(2)TUNEL法在兔动脉易损斑块中阳性反应正常细胞核均匀着绿色,凋亡细胞核呈深浅不一的棕黄色(图2)。脂核区平滑肌细胞中TUNEL阳性细胞百分数增高,与其余三区均有显着性差异(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。脂核区炎症细胞中TUNEL阳性细胞百分数增高,与其余三区差异有显着性(P<0.05,P<0.01,P<0.01)(表1,图2)。

(3)HSP70表达细胞和TUNEL阳性细胞在4个区内差别纤维帽和肩部中HSP70高表达细胞百分数均各大于TUNEL阳性细胞百分数(P<0.05,P<0.01),脂核区TUNEL阳性SMCs、ICs细胞百分数均各大于HSP70阳性细胞百分数(P<0.01,P<0.01)。在中膜平滑肌区HSP70阳性SMCs、ICs细胞百分数分别与TUNEL阳性SMCs、ICs细胞百分数差异有显着性(P<0.01,P<0.05)(表1)。

3 讨论

HSP(热激蛋白)可以调节多种蛋白质的活性和功能,但又不参与靶细胞的组成,所以我们又将其称为“分子伴侣”或“伴侣蛋白”。HSP具有维护细胞内环境稳定性、提高细胞对应激原的耐受性和协同免疫作用[2]。

H S P按分子量大小分为以下几个家族:HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSP(分子量为22～32ku)和泛素(分子量为7～8ku),其中[3～4]HSP60和HSP70能够激活人体血管内皮细胞表达,调节免疫反应。每个家族又由多个成员组成。随着研究的不断深入,新发现的HSP将不断加入相应的家族,也可能组成新的家族。

在HSP家族中,主要的是HSP70家族(分子量为72～80ku),成员最多,共有21种蛋白质,是一组在进化上高度保守的应激蛋白。依据划分标准的不同,对HSP70家族的分类也不完全相同。大致可分为以下4种:第1种是HSP70,也称为HSP72,通常在正常细胞中并不表达或表达量很少。但是在热应激或其它应激原的作用下,则表达迅速增加,属于诱导型HSP70;第2种为HSC70(热应激同源蛋白70,heat shock cog-nate 70),也称为HSP73,是哺乳动物细胞内的结构蛋白,在所有的细胞内均能表达,并且受热诱导,属于结构型HSP70;这2种HSP具有高度的序列同源性(95%)和相似的生物化学特性;第3种是GRP78(葡萄糖调节蛋白78,glu-cose-regulated protein 78),这种蛋白存在于内质网腔内;第4种是GRP75,主要位于线粒体内;GRP78和GRP75在应激时稍有表达,它们在细胞内分别以分子伴侣的形式发挥作用。

HSP70家族具有以下生化特点:(1)它们的氨基端具有弱的ATPase活性,与肌肉的肌动蛋白结构很相似;(2)当ATPase被激活时,可与伸展的多肽结合;(3)还可以保护各种酶免受热损伤,使聚合的蛋白质解聚。通过以上实验,观察到兔易损斑块HSP70在纤维帽区和肩部区高度表达, 细胞成分以炎细胞如巨噬细胞为主,平滑肌细胞次之,可能与该区受到的切应力变化大有关;在基底部表达明显减少,与HSP的保护作用有关,但炎细胞中表达增高,与HSP的诱发炎症有关。

HSP70在抗细胞凋亡、抗氧化和免疫反应中起着重要作用。研究发现,细胞内HSP70水平的增高可以阻断信号通路,抑制应激诱导的JNK激活,从而减少细胞的凋亡。HSP70还能抑制另一种应激激酶p38(HOG1)的活性,但当HSP70家族的单克隆抗体存在时,这种抑制作用就会消除,p38的活性提高,造成细胞损害。另外,研究者还发现当细胞与氨基酸类似物一起孵育时,细胞内异常蛋白积聚,导致JNK、p38等应激激酶的激活,这种激活现象也能被HSP70的过量表达所阻断。因此,在应激状态下,细胞内HSP70家族基因表达水平的增加,可抑制应激激酶激活,具有保护作用。

通过TUNEL技术,检测兔易损斑块中的凋亡细胞,发现凋亡的细胞主要集中在脂核区及其附近,同时HSP呈现低表达,即HSP高表达的地方细胞凋亡少,充分说明了HSP能够防止细胞凋亡,具有细胞保护作用。

[1]张鹏飞,张运,张梅,等.颈动脉粥样斑块应变及应变率分布的初步探讨[J].中华超声影像学杂志,2004,13(8):573～576.

[2]Hayashi K,Imai Y.Tensile property of atheromatous plaque and an analysis of stress in atherosclerotic wall[J].J biomech,1997,30(6):573～579.

[3]Gotto AM.Lipid-lowering therapy for the primary prevention of coronary heart disease[J].J Am Coll Cardiol,1999,33(7):2078～2082.

[4]Ashwini S.Dhume,Krish Soundarajan,William J.Hunter,et al.Comparison of Vascular Smooth Muscle Cell Apoptosis and Fibrous Cap Morphology in Symptomatic and Asyoptomatic Carotid Artery disease[J].Annals of Vascular Surgery,2003,17(1):1～8.