张顺明 袁小敏

江苏省南京市六合区人民医院（211500）

T细胞活化及效应除了需T细胞受体识别MHC-抗原肽复合物外，还需要抗原呈递细胞上的共刺激信号的参与[1]。共刺激分子在T细胞应答的不同时空阶段，对T细胞的活化、凋亡、分化和效应发挥调节作用。B7 家族是最重要的共刺激分子之一，主要包括 B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、B7-H1和B7-H2等。肿瘤坏死因子是细胞因子网络中的重要组成部分，具有强大的抗肿瘤作用和协同效应。本研究观察了肿瘤坏死因子（TNF）诱导人肝癌细胞的凋亡作用，并观察TNF对B7-H1的表达变化。

1 材料与方法

1.1 材料

人肝癌HepG2细胞株购于上海细胞研究所；TNF-α，10万U/瓶，购于南京医药公司；二甲基亚砜（ DMSO），HEPES均购于Sigma公司；胎牛血清购于杭州四季青公司；RPMI-1640培养基购于Gibco公司；Annexin V-FITC/PI试剂盒购于南京凯基生物公司；RT-PCR试剂盒购于大连宝生物公司。

1.2 细胞培养

人肝癌HepG2细胞常规培养于含10%灭活胎牛血清的RPMI-1640培养基中，在37℃，体积分数为5 %的CO2饱和湿度培养箱中进行培养。细胞为贴壁生长，0.25%的胰蛋白酶消化传代，每隔2d换液。取对数生长期细胞进行试验。

1.3 流式细胞仪检测细胞凋亡

收集对照、各浓度（0、100、200、400、800U/mL）TNF-α干预48h后的Hep G2细胞1.0×106/mL，每组3个复孔，每孔取1mL细胞，1000r/min，4℃离心10min，弃上清。加入1mL冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮。1000r/min，4℃离心10min，弃上清。重复用冷的PBS洗2次。将细胞重悬于200µL结合缓冲液。加入10µL Annexin V-FITC和5µL PI，轻轻混匀，避光室温反应15min。加入300µL结合缓冲液，1h内上机检测细胞的凋亡率。

1.4 RT-PCR检测HepG2细胞B7-H1基因表达

取对数生长期细胞约1×106/mL，分别予0、100、200、400、800U/mL干预，37℃培养48h后，加入1mL Trizol试剂，按试剂盒说明书步骤抽提总RNA。每组取1μL总RNA模板建立20μL逆转录反应体系，42℃反应60min，99℃灭活5min。每组各取1μL cDNA模板分别进行PCR扩增，β-actin作为内参照同步扩增。B7-H1基因引物序列为上游5′-TCGCCGTCTCCTACCA-3′，下游5′-GGCAATGATCCCAAAGTA-3′，扩增片断为221bp；PCR反应体系为20μL，反应条件均为 94℃预变性 3min，94 ℃变性 30s，52℃退火30s，72℃延伸40s，共40个循环，最后72 ℃延伸7min，PCR 产物于1.5%的琼脂糖凝胶电泳观察。

1.5 统计学处理

2 实验结果

2.1 凋亡结果

流式细胞仪分析细胞凋亡率见图1，结果显示各浓度组TNF-α干预后，Hep G2细胞凋亡率与对照组相比统计学有显著性差异（P＜0.05），但是各浓度组之间无明显差别（P＞0.05），提示TNF-α可以诱导Hep G2细胞凋亡，但细胞凋亡程度不随TNF-α浓度升高而增加，见表1。

表1 TNF-α作用48h后Hep G2细胞的凋亡率（%）

2.2 RT-PCR结果

用Smartview电泳图像分析软件分析扩增产物的电泳结果，读取HepG2细胞B7-H1和β-actin的斑点密度扫描值，以β-actin为内对照，分别计算不同药物浓度处理后的HepG2细胞的B7-H1与β-actin 比值（图2）。分析结果如表2所示，B7-H1基因在HepG2细胞系呈微弱表达，100、200、400、800U/mL的TNF-α作用48h后，B7-H1基因表达分别有所上调，与对照组相比具有统计学意义（P＜0.05），但各浓度组之间无明显差异（P＞0.05）。

表2 不同浓度TNF-α干预HepG2细胞48h后B7-H1基因表达的灰度比值

图1 不同TNF-α浓度干预的FCM结果

图2 RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果

3 讨 论

目前研究证明免疫功能失调、尤其是T 细胞免疫功能失常，使肿瘤细胞在发生早期能够逃逸免疫监控和免疫攻击，从而发展至临床阶段[2]。机体抗肿瘤细胞免疫主要由T 细胞介导，而T细胞的激活需要3种信号：①特异性刺激信号Ag-MHC复合物；②有共刺激分子提供的共刺激信号；③细胞因子对T细胞的激活[3]。B7-H1是B7分子家族的第3个成员，不同于B7-1、B7-2，它不与CD28、CTLA-4结合，与其配体作用共同刺激T细胞对多克隆刺激素的反应，在细胞免疫反应中可能起负性调节作用[4]。

国内外研究表明，TNF对许多肿瘤细胞如前列腺癌细胞系PC3及某些白血病细胞系等具有明显的抑制生长作用，而对正常细胞无细胞毒性作用[5]。TNF通过以下环节发挥抗肿瘤作用：①通过增强肿瘤细胞 TNF受体表达而增强抗肿瘤作用；②减少蛋白质合成，使细胞损伤修复减少，细胞毒性作用增强；③TNF作用在G2或M期[6]。鉴于TNF在体外实验和动物实验中均有一定抗肿瘤作用，人们在临床中试验性应用TNF治疗肿瘤，但效果并不使人满意，因而有待于进一步地研究其作用机制。

本实验研究结果表明，TNF-α可以通过一定的机制上调HepG2细胞表面B7-H1分子的表达，诱导细胞凋亡，发挥一定的抗肿瘤效应，为以后的进一步研究提供了一定的理论依据。

[1]Baxter AG,Hodgkin PD. Activation rules:the two signal theories of immune activation [J]. Nat Rev Immunol,2002,2 (6):439-446.

[2]Chen L. Co-inhibitory molecules of B7-CD28family in the control of T-cell immunity [J]. Nat Rev Immunol,2004,4 (5):336–347.

[3]Salomon B,Bluestone JA.Complexities of CD28/B7:CTLA-4 costimulatory pathways in autoimmunity and transplantation[J]. Annu Rev Immunol,2001,19:225-252.

[4]Liu X,Bai XF,Wen J,et al. B7H costimulates clonal expansion of,and cognate destruction of tumor cells by CD8 (+) T lymphocytes in vivo[J]. J Exp Med,2001,194 (9):1339-1348.

[5]伏爽.肿瘤坏死因子的研究进展(综述)[J].国外医学免疫学分册,1993,16(5):252-257.

[6]Mcintosh JK,Mule JJ,Krosmick JA,et al. Combination cytokine immunotherapy with tumor necrosis factor α,interleukin-2 and α-interferon and its synergistic antitumor effects in mice[J].Cancer Res,1989,49 (6):1408-1416.