郑胜武 郑清健

福建医科大学省立临床学院（350001）

血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPC）是一种能直接分化为血管内皮细胞的前体细胞。EPC形成于胚胎期，胚外造血启动，卵黄囊的胚外中胚层的一些间充质细胞逐渐聚集成条索或团块状，形成血岛，血岛进一步出现腔隙化改变，中央的细胞分化成造血干细胞，外周细胞则分化为EPC[1]。由于它们共同表达CD133，EPC与造血干细胞被认为来源于同一前体细胞，即胚层造血/成血管细胞[2]。

以前观点认为，EPC仅仅出现于胚胎血管发生阶段，参与人胚胎血管的生成，人出生后即不存在。Asahara等[3]、Shi等[4]分离并证实人类出生后的外周循环血液中存在着能分化为血管内皮细胞的EPC，它在成年机体的血管新生中起重要作用。这一重大发现，为揭开出生后血管新生的机制提供了重要线索。目前，已经证实骨髓来源的EPC对于创伤愈合[5]、肢体缺血[3,6-8]、心肌梗死[9,10]、血管移植物的再血管化[5,11,12]等过程中的血管再生起着重要作用。现将EPC在创伤修复与改善皮瓣血运中的作用机制及研究进展综述如下。

1 EPC促进血管生成的机制

1.1 EPC的动员

不同祖系的细胞由骨髓释放到外周血称为动员，细胞动员机制存在着共同的环节，如黏附、降解、运动、迁移等，但各祖系细胞也有特异性的动员机制。局部的血管损伤能有力地刺激EPC的动员，在缺血、烧伤、创伤等情况下，周围血中的EPC明显增高[5]。调节EPC动员的生长因了包括血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子[13]，它们是通过间接作用于骨髓基质细胞上的受体起作用的，同时VEGF也是EPC的趋化剂，促使EPC趋向缺血组织，其他的细胞因子如IL-3、IL-8、IL-11、干细胞因子及巨噬细胞炎症蛋白la[13]作用不如前3种。EPC与VEGF的关系十分密切，在血管形成的研究中应用VEGF基因治疗周围血管及冠状动脉疾病时，发现血液循环中的EPC数量明显增加，提示原来利用VEGF基因治疗成功的原因部分可能是促进EPC的动员，使其数量增多从而发挥作用[14]。

1.2 EPC与血管新生

血管新生存在两种机制，即血管形成和血管生成。血管形成是血管内皮细胞增殖、迁移，微血管以出芽的方式从已存在的血管床长出形成新的血管分支及毛细血管丛；而血管生成是来自中胚层的血管干细胞，尤其是骨髓来源的EPC原位分化形成血管[14]。传统的观点认为血管形成只存在于成体，而血管生成仅限于胚胎。随着EPC在成体的分离成功，证明血管生成也发生于成体。因此，血管形成、血管生成可能是人类血管新生的基本过程[14]。

1.2.1 治疗性血管形成

利用有促进血管生长作用的生长因子[15]，如VEGF、碱性成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子来促进血管内皮细胞增殖、迁移，从而加强血管形成的治疗方法。应用这类因子（重组蛋白）治疗，由于达到疗效所需要的剂量大、维持时间短、疗效不佳，已很少采用；目前主要以基因转染技术来实现治疗部位生长因子的持续性分泌，来达到治疗目的[16]。但一些研究结果尚不肯定，许多学者认为单个生长因子难以产生明显的临床效果[14,17]。

1.2.2 治疗性血管生成

利用成年机体血液循环中的EPC对缺血组织趋向能力及分化形成血管的生物学性能，可以通过移植EPC或通过诱导趋化、促进EPC动员、增生，使缺血组织局部的EPC数量增多，从而促进成体的血管生成，这种治疗称为“治疗性血管生成”[14]。目前已经证实骨髓来源的EPC对于创伤愈合、肢体缺血、心肌梗死、血管移植物的再血管化等过程中的血管再生起着重要作用。部分研究中心已经将EPC应用于心肌缺血、外周缺血性疾病治疗中，证实了其良好的治疗潜力[18,19]。

1.3 EPC的治疗作用

EPC发挥治疗作用通常被认为是通过两种机制完成的：通过旁分泌多种促进血管新生的因子；分化为成熟的血管内皮后，参与新的血管形成[18,20,21]。与治疗性血管形成相比，利用EPC的治疗性血管生成有几个优点：首先，作为一种以细胞为基础的治疗方法，它不只是能给予受体EPC，而且同时能分泌对血管新生重要的多种生长因子[18,20,21]，He等[22]检测到体外培养的EPC可以分泌VEGF、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子等数十种生长因子。其次EPC具备归巢能力，可以向血管创伤或缺血部位趋化，能在最需要血管新生的部位发挥作用[8]，而且自体的EPC移植无毒性及免疫反应。这些特性使EPC能成为生长因子基因转染的靶细胞，有可能使血管形成和血管生成互相协同、互相促进。EPC在成人机体循环细胞中所占的比例非常小，因此，建立一种良好而有效的体外诱导培养方法，通过体外扩增的方法获得一定数量和纯度的EPC，是将其成功再移植入体内促进受区血管新生的基础。

2 EPC的分离、培养

EPC可以从各种来源中分离，比如骨髓[7,8]、外周血[3]和脐带血[23]等。分离的方法包括根据细胞的表面标志（一般为CD34+、CD133

+、VEGFR2+细胞或其任意组合），通过流式细胞仪[24]或免疫磁珠[25]分离出目标细胞群，然后采用贴壁培养法获得。这种方法获得到的细胞较纯，但是通常由于分离的细胞数量少，难以满足实验研究的需要；并且分离过程相对复杂，费用昂贵。同时，目前对EPC的表型仍然存在争议，有研究发现细胞也能分化成内皮样细胞[26,27]，所以上述表面标志仅具有相对特异性。目前采用比较多的分离方法是通过等密度梯度离心法，然后在专有的内皮细胞诱导培养液中培养[27]。Zan等[28]研究发现，①细胞密度过低时细胞不易存活，适当增加接种细胞密度（106～107/mL），有利于细胞的贴壁、增殖和分化；②原代培养的细胞缺乏细胞间的支持，培养皿预包被纤维粘连蛋白，起支架和促进黏附作用，可以增加贴壁细胞的数量；③培养基的血清浓度不宜过高，一般以5%为宜，过高的血清浓度可能促进细胞向其他方向分化。

3 EPC在创伤修复与改善皮瓣血运中的研究进展

3.1 EPC在创伤修复中的研究进展

创伤修复愈合过程中涉及组织对创伤的一系列复杂反应及多种细胞与周围介质相互作用的过程，组织愈合过程中一个很重要的因素是促进血管新生、血运及时重建，减少因缺血导致的组织坏死，促进新生组织的再生。特别是糖尿病患者，损伤后伤口难以愈合，经常发展成为慢性溃疡。在许多病例中，利用VEGF等生长因了治疗可以促进血管生成，但在一些糖尿病或高胆固醇血症病例中，血管内皮细胞功能缺陷，VEGF等生长因子几乎不起作用，但EPC能克服这种限制，可以提供有活力的血管内皮细胞，因此能促进伴有糖尿病、高胆固醇血症损伤缺血部位的血管新生及愈合[13]，目前国外EPC用于损伤修复的研究主要集中在糖尿病的创面修复[14]。

3.2 EPC在改善皮瓣血运状况中的研究进展

利用EPC的治疗性血管生成治疗可以在皮瓣中促进血管新生，可以减少皮瓣的坏死，提高成活率，可以缩短皮瓣断蒂时间，减少皮肤坏死并发症。EPC具有定向迁移的特性，不但趋向并聚集于缺血肢体和心肌，同样也可以趋向于缺血的皮瓣组织。2004年Park等[29]首先报道了成人外周血单个核细胞诱导的EPC可以促进裸鼠随意皮瓣的存活面积；2009年Zan等[28]报道骨髓来源的EPC可以促进大鼠预构皮瓣血管新生，提高皮瓣存活率。另外，EPC可以作为VEGF等生长因子基因转染的靶细胞，同时联合治疗可以取得更好的效果。易成刚等[30]利用脂质体介导血管内皮细胞生长因子165（VEGF165）基因体外转染EPC、然后移植于裸鼠随意皮瓣，皮瓣旱期断蒂。结果发现转染VEGF165基因的EPCs组和EPCs组移植裸鼠皮瓣后，EPCs整合到缺血部位新生血管中，与对照组的皮瓣存活率分别为97.2%±2.8%、60.3%±2.1%、34.2%±1.8%（P＜0.05），而且前两组毛细血管密度、血流灌注差异均有统计学意义（P＜0.05），较对照组均有明显改善（P＜0.05）。由此得出结论：脐血中的EPCs体外培养后移植体内可促进缺血皮瓣的血管新生，提高存活率，而转染VEGF165基因的EPCs具有更强大的促血管新生的作用。

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